WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     || 2 | 3 | 4 |
КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ ПО БИОФИЗИКЕ Методические рекомендации для студентов 3 курса биологического факультета Калининград 1996 Лабораторные работы по биофизике: Методические рекомендации для студентов 3 курса биологического факультета / Калинингр. ун-т; Сост. В.В. Жуков, Н.Н. Гориленко.

- Калининград, 1996. - 28 с.

В основу лабораторных работ положен ряд задач, разработанных на кафедрах биофизики и химической технологии МГУ им. М.В. Ломоносова.

Составители: кандидат биологических наук В.В. Жуков, кандидат технических наук Н.Н. Гориленко Печатается по решению редакционно-издательского Совета Калининградского государственного университета.

© Калининградский государственный университет, 1996 Лабораторные работы по биофизике Методические рекомендации для студентов 3 курса биологического факультета Составители: Валерий Валентинович Жуков, Николай Николаевич Гориленко Лицензия №020345 от 27.12.1991 г.

Редактор Л.Г. Ванцева.

Подписано в печать 22.05.96 г. Формат 60х90 1/16.

Бум. для множит. аппаратов. Ризограф.

Усл. печ. л. 1,7. Уч.-изд. л. 1,6. Тираж 150 экз. Заказ.

Калининградский государственный университет, 236041, Калининград обл., ул. А.Невского, 14.

Тема 1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В БИОЛОГИИ Лабораторная работа 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЯЗКОСТИ РАСТВОРОВ Цель работы: выявить зависимость вязкости растворов глицерина от их концентрации.

Задачи работы: определить вязкость растворов глицерина при концентрациях (частей) 0; 0,17; 0,28; 0,37; 0,44; 0,50.

Методическая простота и доступность вискозиметрии сочетаются с высокой чувствительностью результатов измерений к конформационному состоянию молекул. Вискозиметрия позволяет определить важный конформационный показатель молекул, связанный с их размерами и формой, - характеристическую вязкость. Если, например, характеристическая вязкость молекулы имеет небольшую величину (3-3,5 см3/г), то это означает, что молекула имеет форму, близкую к сферической. В растворах, содержащих гуанидин хлорид или мочевину, а также агент, разрывающий дисульфидные связи, все белки приобретают конформацию гибкой цепной молекулы независимо от конформации в нативном состоянии. Это дает возможность по характеристической вязкости раствора белка в присутствии денатурирующих агентов определить его молекулярную массу.

Одним из наиболее часто применяемых методов определения вязкости является измерение скорости вытекания жидкости из капилляра.

В потоке, движущемся около стенки сосуда, вследствие взаимодействия молекул жидкости с неподвижной стенкой сосуда и между собой скорость течения различных слоев жидкости, параллельных стенке сосуда, неодинакова. Имеет место зависимость:

V = g y, где V -скорость движения жидкости в слое, отстоящем от стенки на y, g=dV / dy - градиент скорости.

Сила трения между соседними слоями жидкости, отнесенная к единице площади, пропорциональна градиенту скорости:

f = g, где - динамическая вязкость, индивидуальная характеристика данной жидкости, измеряется в Пас = 1 кг/мс.

Кинематической вязкостью () называется отношение динамической вязкости к плотности среды ():

=.

Кинематическая вязкость измеряется в м2/с = 10000 стокс.

Вязкость раствора может значительно отличаться от вязкости чистого растворителя. По величине этого различия можно судить о свойствах молекул растворенного вещества. Удельная вязкость характеризует долю вязкости, обусловленную растворенным веществом, и рассчитывается по формуле:

= уд, - где - вязкость растворителя, а - вязкость раствора.

Эта величина зависит от концентрации раствора. В частности, для раствора жестких не взаимодействующих частиц уд пропорциональна их концентрации.

Коэффициент пропорциональности [] = уд / С называется характеристической вязкостью растворенного вещества и измеряется в см3/г. В частном случае [] зависит только от свойств жестких частиц и является константой в широком интервале концентраций. При исследовании больших гибких молекул межмолекулярным взаимодействием пренебрегать нельзя. Поэтому характеристическая вязкость имеет смысл константы при малых концентрациях. Для определения характеристической вязкости на практике можно воспользоваться графическим способом по уравнению Хаггинса (рис.1).

Рис.1. Графический способ определения характеристической вязкости и константы Хаггинса Отсекаемый отрезок равен характеристической вязкости. Константа Хаггинса К= D / A2.

Для определения характеристической вязкости растворов широкоиспользуются капиллярные вискозиметры типа Убеллоде (рис. 2). Раствор заливается в трубку (а) и засасывается в трубку (б), трубка (д) при этом закрыта.Перед истечением жидкости трубка (д) открывается, в нее засасывается воздух.

Вытекающая из капилляра жидкость “висит” в воздухе и стекает вниз по стенке, так что на выходе из капилляра турбулентное течение возникнуть не может.

Принадлежности: вискозиметр ВПЖ-1, секундомер, мерный цилиндр на 25 мл, резиновая груша, резиновые трубки с краниками.

Ход работы:

1. Ознакомиться по описанию с работой вискозиметра ВПЖ-1.

2. Внести в вискозиметр 20 мл дистиллированной воды и измерить время ее истечения по четырем-пяти измерениям.

3. Последовательно добавляя по 4 мл глицерина, измерить время истечения растворов при заданных концентрациях по четырем-пяти повторам на каждую.

4. По полученным данным рассчитать относительную и удельную вязкости по формулам: отн= t / t; уд / отн - 1, где t Рис.2. Вискозиметр типа время истечения дистиллированной воды.

Убеллоде:

5. Определить графическим способом в и г - метки, отмечающие константу Хаггинса.

время истечения жидкости Лабораторная работа 2. ИЗМЕРЕНИЕ АКТИВНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ ВОДОРОДА Цель работы: ознакомиться с возможностям иономера для биологических исследований.

Задачи работы: определить: а) крутизну водородной функции стеклянного электрода; б) буферную емкость буферного раствора.

Одним из основных методов определения активности ионов водорода является использование ионочувствительных стеклянных электродов. Метод основан на изменении величины электродного потенциала в зависимости от активности ионов в окружающей среде в соответствии с уравнением Нернста:

= + R T n F ln a ( ), где - потенциал стеклянного электрода, - стандартный электродный потенциал, n - заряд иона, а - активность иона водорода, которая связана с концентрацией соотношением а = fc, где f - коэффициент активности (в сильно разбавленных растворах f = 1).

После преобразования получим:

= - 58 p H.

Теоретически график зависимости потенциала электрода от рН представляет собой прямую линию с угловым коэффициентом 58 мв/рН. Этот коэффициент называется крутизной электродной функции. На практике крутизна электродной функции конкретного стеклянного электрода может отличаться от теоретически рассчитанной величины. Электродная система для определения активности ионов в растворе состоит из электродов измерения и электрода сравнения. Обычно в качестве электрода сравнения применяют хлор-серебряный электрод. Измерительный электрод для определения рН представляет собой стеклянную трубочку, на конце которой имеется полый шарик из специального ион-селективного стекла.

Внимание: при включении прибора кнопка “t” должна быть нажата.

Считывание результатов. Самый правый ряд кнопок предназначен для выбора диапазона измерений. Предварительно рН любого раствора измеряют в “грубом” диапазоне -1...19. Показания снимают со шкалы -1...19. Допустим, получено число Х. Оно располагается в одном из поддиапазонов точных измерений (-1...4, 4...9 и т.д.). Нажатием кнопки этого поддиапазона переключить прибор на точные измерения. Искомая величина определяется суммированием первого числа каждого поддиапазона с показаниями нижней шкалы прибора, расположенной над зеркалом. Все измерения и титрования проводить при установке прибора на поддиапазоны точных измерений.

Упражнение 1. Определение крутизны водородной функции Принадлежности: иономер ЭВ -74, растворы К виннокислого кислого и гидроксида кальция.

Ход работы 1. Измерить рН, а затем потенциал электродной системы сначала раствора калия виннокислого кислого, а затем - гидроокиси кальция.

2. Рассчитать крутизну водородной функции S в мВ/рН по уравнению: =- s pH, где 0 = 0. Сравнить полученное значение с теоретически рассчитанной величиной.

Упражнение 2. Определение константы диссоциации слабой кислоты Принадлежности: иономер ЭВ - 74, 0,05 н раствор щелочи, бюретка, раствор слабой кислоты.

Степень диссоциации слабой кислоты зависит от рН раствора. Если процесс диссоциации идет по схеме НА <=> Н+ + А-, то соотношение форм слабых кислот можно рассчитать по уравнению Гендерсона - Хассельбалха:

[A ] pH = pK + lg.

HA [ ] Определение К обычно проводят путем титрования раствора кислоты щелочами. При рН = рК кривая титрования имеет наиболее крутой подъем (рис. 3).

Рис. 3. Кривая титрования Ход работы 1. 20 мл раствора борной кислоты титровать 0,05 н сильным основанием. Регистрировать объем израсходованной щелочи на каждое изменение рН на 0,единицы рН до ~ 10. Титровать при непосредственном контроле за величиной рН.

2. Рассчитать соотношение ионных форм в растворе для всех точек, равных рН + 0,5n, где рН - исходная кислотность раствора борной кислоты.

Упражнение 3. Определение буферной емкости растворов Ход работы 1. Титровать две пробы фосфатного буферного раствора объемом по 20 мл 0,05 н растворами HCl и KOH до тех пор, пока рН не изменится до ~10 в щелочную и до ~3 в кислую сторону. Показания прибора снимать при изменении рН на 0,5.

2. Пересчитать полученные объемы Vi для 0,1 н щелочи и кислоты, приводящие к смещению рН на 0,5 единицы по формуле: С = 2,5V, где V - титр для промежутка одной единицы рН, V = Vi + Vi, Vi и Vi... - титры для промежутков 0,5 единицы рН, рН - начальное значение кислотности буферного раствора.

3. Рассчитать буферную емкость раствора по формуле: = + dC/dpH и построить график зависимости от рН.

Тема 2. КИНЕТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Цель работы: установить характер зависимости биологических процессов от изменения температуры среды.

Задачи работы: а) определить температурный коэффициент гемолиза эритроцитов; б) установить зависимость скорости фотосинтеза от температуры в листьях роголистника.

Лабораторная работа. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА СКОРОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ Возрастание скорости химических реакций с повышением температуры описывается уравнением Аррениуса: K=pzexp(-E/R*T), где К - константа скорости реакции, z - частота столкновений между молекулами, Е - энергия активации, р - стерический фактор, зависящий от конфигурации молекул.

Величина, показывающая, во сколько раз увеличивается скорость реакции при повышении температуры на 10° С, называется температурным коэффициентом Q10. Между температурным коэффициентом и энергией активации существует зависимость: Е=0,46T1T2lg Q10, где Т2=Т1+10, и эти величины выражены в значениях абсолютной шкалы.

Этой зависимостью пользуются и для вычисления энергии активации биологических процессов. Однако применение закона Аррениуса и термина “энергия активации” к биологическим объектам относительно, так как химические реакции в них осуществляются в многофазной гетерогенной среде, где протекают одновременно тысячи химических реакций, требующих определенного температурного оптимума. Часто при повышении температуры выше оптимальной происходит уменьшение скорости биологических реакций. Поэтому для оценки биологических процессов вместо Е вводится величина - кажущаяся энергия активации.

Упражнение 1. Определение температурного коэффициента гемолиза эритроцитов крови человека Приборы и принадлежности: фотоколориметр КФК-2, самописец ЭПП или секундомер, скарификатор, смесь Никифорова, стаканчики на 50 мл, 0,1 н соляную кислоту, мерный цилиндр, раствор Рингера для теплокровных, спирт, вата, пипетки на 2 и 1 мл.

Ход работы 1. Подготовить к работе фотоколориметр и самописец ЭПП. Фотоколориметр прогреть с раскрытой крышкой рабочей камеры в течение 10 мин. и ручками “Установка 100” установить стрелку на 0 (100 % пропускания). ЭПП прогреть в течение 10 мин.

2. Стерильным скарификатором проколоть палец и поместить 1-2 капли крови в 20 мл раствора. Проверить степень пропускания света взвесью. Если она меньше 30 %, то добавить раствор Рингера и довести степень пропускания света в предел 30 - 45%.

3. Приготовить 0,005 н раствор соляной кислоты на растворе Рингера. К 2 мл взвеси крови, помещенным в фотоколориметрическую кювету, влить 1 мл кислоты. Засечь время по часам либо включить самописец; одновременно снять нулевое показание колориметра. Если используются часы, отмечать показания колориметра через каждые 30 с. Процесс гемолиза считается завершенным, когда показания прибора не изменяются (три числа подряд неизменны). Повторить опыт.

4. Взвесь форменных элементов крови и раствор кислоты подогреть на 10° С относительно температуры воздуха. Провести аналогичные мероприятия и измерения. Опыт повторить.

5. Вычислить температурный коэффициент гемолиза и кажущуюся энергию активации процесса.

Упражнение 2. Влияние концентрации кислоты на скорость гемолиза Принадлежности: приборы те же, что и в упр. 1; растворы HCl в физрастворе с концентрациями: 0,0005 М, 0,001 М, 0,002 М, 0,005 М, 0,01 М, 0,02 М, 0,М.

Ход работы 1. Приготовить растворы соляной кислоты путем последовательного разбавления. Исходная концентрация равна 0,1 М. Разбавление вести в соотношениях:

1:1; 1:1,5; 1:1; 1:1; 1:1,5; 1:1; 1:1.

2. Начиная с меньшей концентрации, провести гемолиз взвесей эритроцитов, добавляя по 1 мл раствора кислоты в 2 мл взвеси.

3. Определить время 50% гемолиза по среднему значению оптической плотности между начальной и конечной.

4. Построить график зависимости скорости 50%-го гемолиза от логарифма концентрации кислоты.

Упражнение 3. Определение температурного коэффициента и энергии активации образования кислорода при фотосинтезе у роголистника (Ceratophyllum demersum L.) Принадлежности: термометр, колба 0,5 л, микроволюметр (цена деления мкл), газотводные трубки, стаканчик, раствор любого цветного вещества.

Ход работы 1. Включить источники света (лампа дневного света, две лампы накаливания мощностью 200-300 вт). Лампы накаливания размещать на расстоянии не менее 1м от установки.

2. Собрать установку для фотосинтеза и измерения объема кислорода (рис.

4), посредством вспомогательной трубки установить показания манометра на 0.

В течение 5 мин. проверить герметичность установки, а также влияние нагрева на ее показания.

Примечание: при сборке максимально исключать нагрев установки руками.

Пробку смочить водой.

Рис 4. Установка для фотосинтеза:

1 - колба с водопроводной водой, 2 вспомогательная трубка, 3 - микроволюметр, 4 - зажим, 5 - источник света 3. Поместить шесть-восемь веточек роголистника в колбу, обрезав предварительно черешок скальпелем. Дождавшись начала фотосинтеза, закрыть колбу пробкой.

4. Установить показания манометра на 0 и измерить объем кислорода через мин.

5. Измерить температуру воды в установке. Отсоединить пробку и нагреть воду на 5,5° С относительно начальной температуры на плитке при постоянном перемешивании. Быстро собрать установку и снова провести опыт в течение мин.

6. Проконтролировать температуру воды. Нагреть воду на 10,5° С относительно начальной температуры. Провести опыт.

7. Провести те же измерения при Тi= T+Tj. Tj=15,5; 20,5; 25,5; T - начальная температура.

8. Разобрать установку. По полученным данным построить график зависимости скорости фотосинтеза от температуры и рассчитать температурный коэффициент и энергию активации в пределах увеличения скорости процесса.

Тема 3. ПРОНИЦАЕМОСТЬ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ Лабораторная работа Цель работы: изучить активные транспортные свойства биологических систем.

Задачи работы: 1) изучить активный транспорт ионов натрия и метиленового синего через кожу лягушки; 2) изучить влияние ядов на активность транспорта ионов натрия и метиленового синего через кожу лягушки.

Являясь открытой термодинамической системой, клетка постоянно осуществляет обмен с окружающей средой. Такой обмен возможен благодаря способности клетки пропускать различные вещества через свою оболочку. Эта способность называется проницаемостью. Проблема клеточной проницаемости включает в себя исследование кинетики транспорта вещества в клетку и из клетки и механизма распределения вещества между клеткой и средой в стационарных условиях.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.