WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 | 2 ||

Если исследуемая сыворотка содержит значительное количество АФП (более чем 50 мг/мл), то линия преципитации этого антигена с антисывороткой может не образовываться В этом случаеиспытуемую сыворотку следует раз.

вести в два раза физиологическим раствором и повторно поставитьреакцию;

4. Отрицательной (-) - линия преципитации компонентов иммунодиагностикума достигает своими концами лунок с исследуемой сывороткой и физиологическим раствором (рис.3 г).

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 6.

Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови человека методом простой радиальной иммунодиффузии по Манчини в модификации Стефани.

Широкое распространение в клинических иммунологических лабораториях получил количественный метод определения иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgА, предложенный Манчини и сотр. в 1964 г. Он основан на одномерной радиальной иммунодиффузии исследуемой сыворотки в агаровом или агарозном геле, содержащем моноспецифические сыворотки с соответствующими антителами против IgG, IgM, IgA. Названные иммуноглобулины выступают в роли антигена. Линия преципитации между антигенной детерминантой исследуемого белка и антителами моноспецифической антисыворотки в геле имеет форму круга вокругстартовой лунки. Площадькруга прямо пропорциональна концентрации антигена в исследуемой пробе. В связи с этим концентрацию иммуноглобулинов в испытуемой пробе можно определитьпо предварительно построенной калибровочной прямой, представляющей собой зависимостьмежду диаметром кольца преципитации и концентрацией иммуноглобулина в стандартных пробах с известным количеством белка.

Содержание иммуноглобулинов в кровотокезависит, с одной стороны, от интенсивности их синтеза плазматическими клетками, последующего использования в иммунных реакциях и скорости распада, а с другой стороны - от их способности сорбироватьсяна поверхности циркулирующих в крови лейкоцитов. Кроме того, частьиммуноглобулинов человека депонируетсяв лимфоидной, мышечной, соединительной тканях различных органов, а также в тканевой жидкости. В крови наблюдаетсядинамическоеравновесие между молекулами иммуноглобулинов, находящихсяв плазме в свободном (растворенном) состоянии и молекулами иммуноглобулинов, сорбированными на клеточной поверхности. Изменения клеточного и гуморального состава, физико–химических ре акций плазмы крови под влиянием физических нагрузок и физиологических ре акций приводят к сдвигу данного равновесия в ту или иную сторону.

Необходимоеоборудование: препараты моноспецифических сывороток против сывороток иммуноглобулинов человека (IgG, IgM, IgA), полученные путем иммунизации животных (кроликов или баранов) соответствующими, очищенными иммуноглобулинами, используемыми в качестве антигенов, агар Дифко, веронал – мединаловый буфер, 0,9% раствор хлорида натрия, 1% раствор мертиолата, исследуемаясыворотка крови человека, чашки Петри, пробойник лунок в геле, трафарет, водянаябаня, термометр, эксикатор, пипетки и микропипетки, бинокулярнаялупа МБС-9 с микролинейкой в окуляре.

Техника определения.

Последовательностьпроведения определения иммуноглобулинов в сывороткекрови человека методом простой радиальной иммунодиффузии по Манчини представлена на рис.4.

Рассмотрим подробнее отдельные стадии данной работы.

1. Приготовление 2% раствора агара в 0,1 молярном веронал - мединаловом буфере, рН 8,56: агар Дифко поместитьв мерный флакон и залить мл дистиллированной воды, несколько раз перемешать, затем взвеситьагара расплавитьна кипящей водяной бане. К расплавленному агару добавитьравный объем веронал – мединалового буфера и 2 мл 1% раствора мертиолата.

Разлитьагар в пробирки по 10-12 мл, закрытьпробками, хранитьдо применения в холодильникепри 4 оС.

2. Приготовление рабочих растворов агара с моноспецифическими сыворотками против иммуноглобулинов человека осуществляют непосредственно перед проведением иммунодиффузии.

Растворы антисыворотокготовят непосредственно перед смешиванием с раствором агара по инструкции, прилагаемой к коммерческим наборам антисывороток дляопределения иммуноглобулинов человека в сыворотке. На водяной бане (56 оС ) разогреть 18-20 мл 2% раствора агара, сюда же поместитьпробирки с растворами антисывороток.

3. Когда температуры растворов сравняются соединить агара и, 6 мл 6 мл антисыворотки, смесь осторожно перемешать, избегаяобразования пузырей воздуха, затем быстро слитьв чашку Петри.

4. Через 20-30 мин. послезастывания агара на слоеагарового геляс помощью пробойника сделатьпо трафарету стандартные отверстия диаметром 2,0-2,5 мм. Послеэтого пастеровской пипеткой или трубочкой меньшего диаметра с помощью водоструйного насоса отсасывают из лунок гелевые пробки так, чтобы краялунок не деформировались.

5. В лунки внести по 2 мкл исследуемых сывороток и стандартных растворов коммерческих сывороток дляполучения калибровочной кривой.

6. Чашки Петри поместитьво влажную камеру при 4оС. Длительность радиальной иммунодиффузии для IgG и IgA – 24 ч., для IgM - 48 ч.

В течение этого времени антиген диффундирует в гельи образует с антителами растворимые комплексы (при избытке антигена). Комплексы продолжают диффундировать связывая все большее количество антител до тех пор,, пока не будет достигнута точка эквивалентности и не произойдет осаждение комплексов с образованием кольца. По диаметру зоны, ограниченной кольцом преципитации, определяют ее площадь. Величина площади пропорциональна концентрации исследуемого антигена.

Разведение моноспецифической Приготовление 2 % раствора сыворотки против агара в веронал-мединаловом о о IgG, IgM, IgA; (56 С) буфере, pH 8,6; 56 С о Смешивание (56 С) Нанесение слоя агара в чашки Петри Вырезание лунок Внесение исследуемых и стандартных растворов сыворотки в лунки (2мкл) Иммунодиффузия (24-48 ч, о 4 С, влажная камера) Измерение диаметра кольца преципитации Расчет количества иммуноглобулинов по калибровочной прямой Рис. 4. Схема проведения определения иммуноглобулинов методом простой радиальной иммунодиффузии 7. Диаметры колец преципитации измеряют, помещаячашка Петри с влажными неокрашенными гелями на предметный столбик бинокулярной лупы МБС-9 с микролинейкой в окуляре, просматриваяи замеряя кольца преципитации при малом увеличении (х 8).

Перед снятием результатов рекомендуется обработать гель теплым 5% раствором хлорида натрия, что способствует удалению всех белков, не принявших участия в образовании преципитата. Преципитаты можно обработать красками длябелков (бромфенол синий, амидочерный).

Расчет количества иммуноглобулинов в испытуемой сывороткеосуществляют с помощью калибровочной прямой, построение которой осуществляют на полулогарифмической бумаге оси абсцисс откладывают диаметры колец. На преципитации (-в мм), на оси ординат - концентрацию иммуноглобулинов (С – мг/мл) в стандартных пробах (рис.5).

С, мг/мл.

.

.

d, мм 0 5 10 15 20 25 Рис. 5. Калибровочная прямая для расчета иммуноглобулинов в исследуемой сыворотке Дляопределения уровня иммуноглобулинов в испытуемой сывороткена оси абсцисс откладывают диаметр кольца преципитации исследуемой сыворотки и восстанавливают перпендикуляр до пересечения с прямой. Эту точку пересечения проецируют на осьординат, что соответствует содержанию иммуноглобулина определенного типа в сывороткекрови.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение поверхностного антигена гепатита В (НВSАg) методом встречного иммуноэлектрофореза в геле.

Заболевание гепатитом у людей вызывают разнообразные ДНК- и РНКсодержащие вирусы. Они принадлежат к разным семействам и в соответствии выявления определенного типа вируса выделяют (классифицируют) различные виды вирусного гепатита А, В, С, D, Е.

Впервые частицы вируса гепатита В (HBV) обнаружил Д. Дейн в 1970 г. и позже они были названы частицами Дейна. Эти частицы (или вирионы ) сферической формы с диаметром 42 нм состоят из нуклеокапсида, образованного капсомерами, и липосодержащей внешней оболочки. В состав генома HBV входят кольцевая молекула ДНК с однонитевым участком, белки, ферменты, липиды и углеводы.

В вирусе гепатита В обнаружено 4 антигена: HBS, HBc, HВ e и HBx.

HBs – антиген (ранее его называли австралийским антигеном) – это гликопротеин с липидным компонентом. Он содержитсяво внешней оболочкевириона (отсюда пошло название поверхностный антиген), состоит из двух полипептидных фрагментов. Один из них отвечает за адсорбцию вируса на специфических рецепторах гепатоцитов. Другой фрагмент обладает выраженными иммуногенными свойствами.

HBs – антиген обнаруживается в крови и имеет диагностическоезначение.

В организме больных гепатитом В синтезируютсяантитела к трем антигенам HBs, HBc и Hbе.

Длявыявления в сывороткечеловека поверхностного антигена гепатита В (HBs ) и антител к HBs - антигену используетсяспециальный иммунодиагностикум, состоящий из двух лиофилизированных препаратов: I) моноспецифической кроличьей антисыворотки к HBs - антигену (АТ) и 2) человеческой сыворотки, содержащей HBs - антиген (АГ). Перед употреблением содержимоеампул растворяют в тех объемах физиологического раствора, которые указаны на этикетках ампул.

Определение антигена HBs в сыворотке крови человека осуществляют методом встречного иммуноэлектрофореза в геле.

Метод встречного иммуноэлектрофореза основан на различной подвижности в электрическом поле HBs -антигена и антител к нему. Антиген движется в направлении к аноду, антитела движутся к катоду. При их взаимодействии образуетсяполоса преципитации, расположеннаяперпендикулярно к направлению движения тока.

Необходимоеоборудование: прибор дляэлектрофореза белков на бумаге, иммунодиагностикум на антиген гепатита В (HBs ) и антитела к нему, 1% раствор агара Дифко, Na – ацетатбарбиталовый буфер рН 8,1 - 8,4, стеклянные, пластины размером 9х12 см, штамп дляпросечения лунок в агаре. Наружный диаметр трубочек в штампе 4 мм, расстояние между центрами отверстий лунок по направлению тока – 8 мм, между центрами отверстий в ряду – 8мм. Если штампа нет, то контуры лунок можно прорезать металлической трубкой того же диаметра. Для соблюдения правильного расстояния между лунками под пластинку с агаром кладут специальный трафарет, нарисованный на миллиметровой бумаге.

Техника определения.

15 мл 1% раствора агара Дифко, приготовленного на Naацетатбарбиталовом буфере, рН 8,1-8,4, наливают на обезжиренную пластинку, расположенную на строго горизонтальной поверхности.

После застывания агара в нем по трафарету просекают контуры лунок, агаровые пробки из лунок удаляют отсасыванием.

В лунки вровень с поверхностью агара капилляром вносят АГ и АТ иммунодиагностикума, а также испытуемые сыворотки по схеме, представленной на рисунке 6. В первую и последнюю пару лунок ряда вносят АГ и АТ иммунодиагностикума дляконтролярежима опыта. В лунки, расположенные на стороне катода, вносят АГ иммунодиагностикума и испытуемые сыворотки. В лунки, расположенные на стороне анода, - антитела иммунодиагностикума. Послезаполнения лунок стекло помещают в прибор дляэлектрофореза. На два противоположных краястекла со стороны анода и катода кладут двойные, смоченные в буферефильтровальные бумажки размером 9 х 12. Фильтровальные бумажки должны закрывать 0,5-1 см поверхности агара и плотно к нему прилегать. Свободный конецбумаги (12 см) опускают в электродный сосуд, в котором налит буфер Послевключения прибора устанавливают напряжение 120-160 В, силу.

тока – 30 мА. Через 1,5-2 часа прибор отключают, бумажные соединители убирают и производят учет результатов. Вначалепроверяют реакцию у контрольных лунок. Полоса преципитации АГ-АТ иммунодиагностикума должна быть расположена ближе к лункес антигеном в связи с тем, что молекулы антител обладают большей подвижностью, чем молекулы антигена, они проходят большее расстояние до взаимодействия с антигеном. Этим они отличаютсяот других неспецифических полос, которые могут образовыватьсяпри проведении реакции методом встречного иммуноэлектрофореза, так как в сывороткечеловека может присутствоватьнесколько преципитирующих систем. Перед учетом результатов рекомендуетсяпластинку с агаром поместитьна 1 час в 10 % раствор NaCl.

Положительной на присутствие HBs - антигена считается та сыворотка, которая с АТ имунодиагностикума образует полосу преципитации, расположенную ближе к лунке с исследуемой сывороткой и находящуюся на одной прямой с полосой преципитации у контрольных лунок.

При исследовании сыворотокдляобнаружения антител к HBs - антигену реакцию ставят по той же схеме (только вместо АТ иммунодиагностикума заливают в лунки антиген иммунодиагностикума).

Рис. 6. Схема расположения лунок при проведении АТ АГ встречного иммуноэлектрофореза для обнаружения в АТ ИС1 сывороткекрови человека антигена HBs АТ ИСОбозначения:

АГ – место нанесения антигена НВs иммунодиагностикуАТ ИСма;

АТ – место нанесения антител к НВs – антигену;

АГ + АТ ИС1 – ИС3 – место нанесения исследуемых сывороток.

Катод Анод СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Основная литература 1. Галактионов В.Г. Иммунология : учеб. пособие по биол. специальностям / В.Г. Галактионов. – М. : Academia, 2004. – 523 с.

2. Хаитов Р.М. Иммунология / Р.М. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. – М. : Медицина, 2000. – 432 с.

Дополнительная литература 1. Практикум по иммунологии : учеб. пособие / под ред. И.А. Кондратьевой, В.Д. Самуилова. – М. : Изд-во МГУ, 2001. – 224 с.

2. Ройт А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д.Мейл. – М. : Мир, 2000. – 592 с.

Составители:

Путинцева Ольга Васильевна, Артюхов Валерий Григорьевич Редактор Тихомирова О. А.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.