WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 || 3 |

Кровь резус – положительных и резус – отрицательных доноров О(I) группы длястандартных приготовления эритроцитов берут не более чем за 2-дня до исследования в количестве 1-3 мл в обычные пробирки без стабилизатора. Послесвертывания крови на дне пробирки остаетсянебольшоеколичество эритроцитов, которые и применяют для исследования. Эритроциты берут со дна пробирки пастеровской пипеткой, если при этом захватываетсянебольшое количество собственной сыворотки, то это не влияет на ход реакции. Дляисследования можно братькровь с цитратом натрия. В этом случаеэритроциты необходимо отмытьизотоническим раствором NaCl.

б) Определение неполных резусных антител в сывороткекрови.

В пробирки вводят по одной капли (0,05 мл) RhоD(+) эритроцитов, приготовленных в качестве стандарта, прибавляют по две капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, подогретого до разжижения в теплой воде при температуре 4648 оС. Раствор желатина необходимо тщательно просмотретьперед применением. При помутнении или появлении хлопьев, а также при потереспособности застыватьпри температуре желатин нельзя использоватьдляработы. По 4-8 оС слеэтого впробирку вводят две капли (0,1 мл) испытуемой сыворотки. Пробирку встряхивают дляперемешивания ее содержимого и помещают в водяную баню при температуре 46 – 48 оС на 5 минут или в суховоздушный термостат на 30 мин. По извлечении из водяной бани в пробирку наливают 3-5 мл изотонического раствора NaCl. Содержимоепробирок перемешивают и наблюдают ре зультат (наличие или отсутствие агглютинации эритроцитов) невооруженным глазом, через лупу или с помощью микроскопа.

Принято считать что испытуемая сыворотка содержит неполные анти, эритроцитарные резус – антитела, если в результатепроведения реакции конглютинации наблюдается агглютинация резус – положительных эритроцитов.

При этом в контроле с резус – отрицательными эритроцитами агглютинация должна отсутствовать.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 3.

Определение титра неполных резус – антител в сыворотке крови человека.

Определение титра резусных антител в сыворотке крови RhоD(-) бере менных женщин имеет важноедиагностическоезначение, так как в зависимости от количества RhоD-антител возможен выкидыш, рождение мертвого плода или живого ребенка с врожденной гемолитической болезнью.

Необходимоеоборудование: исследуемаясыворотка, стандартные резус – положительные эритроциты О(I) группы, 0,9% раствор хлорида натрия, пробирки, пипетки Пастера, 10% раствор желатина, водянаябаня или суховоздушный термостат, секундомер, микроскоп.

Техника определения.

В штатив устанавливают десятьпробирок с обозначениями: «I:2», «I:4», «I:8» и так далее до «I:I024».

Во все пробирки вводят по две капли (0,1мл) изотонического раствора NaCl.

В первую пробирку этой же пипеткой вводят 2 капли (0,1мл) исследуемой сыворотки. Послеперемешивания две капли смеси из первой пробирки переносят во вторую, содержимое второй пробирки перемешивают и 2 капли смеси переносят в третью, из третьей пробирки - в четвёртую и так до последней пробирки, из которой две капли смеси удаляют. В результатев пробирках получают разведения сыворотки от I:2 до I:I024.

Во все пробирки добавляют по одной капле (0,05 мл) смеси RhоD(+) эритроцитов О(I) группы крови, полученных от 4-5 доноров и приготовленных по методике, описанной в лабораторной работе 2.

Во все пробирки вводят по две капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения в теплой водепри температуре 4648 оС.

Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при температуре 4648 оС на 10 минут или в суховоздушный термостат на 30 мин.

По извлечении пробирок из водяной бани в них доливают по 5-8 мл 0,9% раствора NaCl и наблюдают результат. Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация, принимается за титр выявленных неполных резус – антител.

Если агглютинация эритроцитов наблюдаетсяво всех разведениях сыворотки, то, следовательно, титр резус – антител в исследуемой сыворотки выше I:I024. В этих случаях следует продолжитьразведение сыворотки и далее продолжатьисследование, как сказано выше (см. пункты 4-7).

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 4.

Определение титра - и -агглютининов (нормальных антител) в сыворотке крови человека.

На поверхности эритроцитов человека находится большое количество специфических антигенов (изоантигенов), что позволяет делитькровь людей по иммуногенетическим признакам на разные системы. Среди 15 систем эритроцитарных антигенов особоеместо занимает система АВО. Она была открыта в 1900 г. К. Ландштейнером и включает в себя четыреосновных группы крови, которые представляют собой комбинации из двух изоантигенов А и В на поверхности эритроцитов и двух антител (- и -изогемагглютининов) в плазме крови (табл.).

У людей с группой крови О(I), не имеющих антигенов А и В, синтезируетсявещество Н. Аллельные гены А и В кодируют трансферазы, которые присоединяют к веществу Н при синтезе антигена А N-ацетилгалактозамин (группа крови АII), а при синтезе антигена В - галактозу (группа крови ВIII). У людей с группой крови АВIV осуществляетсясинтез и А-, и В - антигенов. При отсутст вии данных антигенов на поверхности эритроцитов в организме плода в процессе его формирования (на 6 месяца внутриутробного развития) начинается образование групповых антител. Данные антитела получили название - и изогемагглютининов или нормальных (естественных) антител. Это полные, холодовые (15-20 оС ), неустойчивые (инактивируютсяпри нагревании сыворотки о при 70 С в течение 10 мин.) антитела, относятсяк классу иммуноглобулинов IgМ. Они не проходят через плаценту и не могут повредитьэритроциты плода, на которых присутствуют антигены, отличные от антигенов матери.

Начинаяс 9-й недели внутриутробного развития, эритроциты плода могут попадатьв кровоток матери в результатевозможного смешивания крови в лакунах формирующегосятрофобласта. В случаенесовместимости антигенов по системе АВО, эритроциты плода иммунизируют мать и инициируют продукцию антигрупповых антител. Эти антитела относятся к IgG, они свободно транспортируются через плаценту, обладают цитотоксическими свойствами, повреждают клетки крови зародыша и приводят к развитию гемолитической болезни плода и новорожденного. Чаще всего межгрупповой конфликт по антигенам системы АВО возникает, когда у матери группа крови О(I), а у плода – А(II), но так как из нескольких аллотипов антигена А (А1, А2. А3, А4, А5, А6, и т.д.) наиболее иммуногенным являютсяаллотип А1, то влиянию цитотоксических IgG -гемолизинов оказываются подвержены гомозиготные А1 А1 эмбрионы. Поэтому межгрупповые конфликты встречаютсядовольно редко (менее 10% случаев от общего числа родов). Кроме того, антиген В мало иммуногенен, а группы крови В(III) и АВ (IV) встречаютсяредко (табл. 1). Иногруппный конфликт при первой беременности клинически проявляетсяугрозой прерывания беременности или выкидышем. При повторной беременности цитотоксические IgG редко проявляют своеотрицательноевоздействие на плод.

Таблица Группы крови человека Группы крови 01 АП ВШ АВIV Наличие агглютиноге- - А В А и В нов (изоантигенов) на мембране эритроцитов Наличие агглютининов и - (антител) в сыворотке крови Частота встречаемости 46 % 42 % 9 % 3 % в популяции Титры -антител у человека обычно равняются I:32 - I:64, -антител-I:16 - I:32. Однако эти величины колеблютсяв зависимости от времени года и значительно снижаютсявесной. Наследование - и -изогемагглютининов происходит в коррелятивной зависимости от А- и В - антигенов в видетрех сцепленных признаков: О, А, и В. При взаимодействии одноименных антигенов и антител (А+ и В +) in vitro и in vitro происходит агглютинация эритроцитов, что особенно опасно при переливании крови. В связи с этим при трансфузиях до норской крови обязательно осуществляют проверку ее совместимости с кровью реципиента.

Определение титра естественных антител к А- и В – антигенам осуществляют не только при возникновении конфликта по антигенам системы АВО между матерью и плодом, но также и при приготовлении высокоактивных стандартных сывороток, дающих крупную агглютинацию эритроцитов, при определении групповой принадлежности крови человека.

Необходимоеоборудование: сыворотка крови человека, планшет длятитрования сыворотки, 0,9% раствор хлорида натрия, пипетки Пастера, секундомер, стекляннаяпалочка, эритроциты группы А и эритроциты группы В.

Техника определения.

Для определения титра агглютининов в исследуемой сыворотке готовят разведение ее в изотоническом растворе NaCl. Для этого на специальный планшет «раскапывают» 0,9% раствор хлорида натрия (10 капельпо 0,1 мл). Затем в первую каплю той же пипеткой добавляют 0.1 мл исследуемой сыворотки, перемешивают ее с физиологическим раствором. Из этой капли 0,1 мл смеси переносят во вторую каплю, снова перемешивают и 0,1 мл смеси переносят в третью каплю и так до последней десятой капли. В результатена планшетеобразуетсяразведение сыворотки от I:2 до I:I024.

Рядом с каждой каплей разведенной сыворотки наносят маленькую каплю (0,01 мл) стандартных эритроцитов группы А, когда титруют -агглютинины, и эритроциты группы В, когда титруют -агглютинины. Соотношение эритроцитов и сыворотки должно бытьприблизительно I:10.

Каждую каплю эритроцитов тщательно перемешивают с сывороткой сухой стеклянной палочкой (размешивание начинают с самого большого разведения). Послечего планшет осторожно покачивают, оставляют в покоена 1-1,мин., затем планшет снова покачивают и одновременно наблюдают результат.

Реакцию проводят в течение 5 мин.

Наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдалась агглютинации стандартных эритроцитов до истечении 5 мин., принимают за титр агглютининов в этой сыворотке.

II. Реакции преципитации Преципитация – это реакция образования комплексов антиген-антитело при взаимодействии растворимых антигенов и соответствующих им антител.

Антитела, вызывающие преципитацию антигенов, называют преципитинами.

Иммунные комплексы, образующиесяв результатереакции преципитации получили название преципитатов.

Гейдельберги Кэнделл установили зависимостьпротекания реакции пре ципитации от количественного соотношения антигенов и антител, участвующих в реакции. Графическоеизображение результатов реакции преципитации, протекающей в условиях постоянной концентрации антител и добавления постепенно увеличивающихсяколичеств антигена в пробе, получило известность как «кривая преципитации Гейдельбергера». Данная кривая представлена на рис.I, она имеет три зоны :

1. Зона избытка антител: наблюдаетсяобразование преципитатов, но в надосадочной жидкости имеютсясвободные антитела, не связанные с антигеном из-за количественного недостатка последнего;

Количество Зона преципитата избытка антител о (мкг) о о о о о о о Зона избытка о о антигена Зона эквивалентности Количество добавленного антигена (мкг) Рис. 1. Кривая преципитации Гейдельбергера Обозначения:

- антитела;

о - антиген.

2. Зона эквивалентности: в надосадочной жидкости отсутствуют свободные антитела и антигены ; все антитела связаны с антигенами, образуется максимальноеколичество нерастворимого преципитата;

3. Зона избытка антигена: образуютсямелкие растворимые комплексы антиген-антитело. В надосадочной жидкости имеютсясвободные антигены, для связывания которых не хватает свободных антител.

Криваяпреципитации Гейдельбергера нашла применение при разработке количественных методов анализа антигенов и антител, основанных на реакции преципитации. Так, при нефелометрическом методеоценки преципитации, базирующемсяна измерении светопоглощения иммунного комплекса при 450 нм, используетсясоотношение антитело: антиген, характерноедлявосходящей части кривой Гейдельбергера (зона избытка антител). На способности образовыватьнерастворимые преципитаты в зоне эквивалентных количественных соотношений антител и антигенов основываетсяреакция определения иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии. Реакции преципитации лежат в основе различных модификаций метода иммуноэлектрофореза.

Методы иммунодиффузии являютсявариантами реакции преципитации, в которых взаимодействие антигена с антителами происходит не в жидкости, а в геле, что позволяет лучше выявлятьи фиксироватьрезультаты взаимодействия.

Чаще всего для работы используются агаровый, агарозный или полиакриламидный гели.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 5.

Полуколичественное определение альфа - фетопротеина в сыворотке крови человека методом двойной иммунодиффузии в геле.

Альфа – фетопротеин (АФП) относитсяк раково – эмбриональным антигенам (РЭА), которые представляют собой дифференцировочные антигены, экспрессируемые во время развития плода. Это гликопротеин с молекулярной массой около 60-70 кДа, содержащийсяв высоких концентрациях в плазме крови в эмбриональный период развития человека. В сывороткекрови взрослого организма АФП присутствует в следовых количествах (1,5-1,6 нг/мл). Содержание его резко возрастает в крови женщин во время беременности, а также при развитии злокачественных опухолей печени (первичные клеточные карциномы печени и тератобластомы), что используетсядлядиагностики последних.

Дляопределения в сывороткекрови человека АФП применяют серологическую реакцию с использованием специальных иммунодиагностикумов, включающих в себя лиофильно высушенные препараты моноспецифической кроличьей антисыворотки против альфа – фетопротеина человека (АТ) и альфа – фетопротеина (АТ). Реакцию преципитации осуществляют методом двойной иммунодиффузии в агаровом геле, в процессе которой наблюдаетсядиффузия и антигена, и антитела. На том месте, гдепроисходит взаимодействие АГ и АТ (с перекрестным связыванием и осаждением иммунных комплексов) образуется линия преципитации.

Необходимоеоборудование: лиофильно высушенный препарат моноспецифической кроличьей антисыворотки, содержащей антитела против АФП человека; лиофильно высушенный препарат АФП, 1% раствор агар-агара, 0,9% раствор хлорида натрия, исследуемые сыворотки крови человека, стеклянные пластины или чашки Петри, стандартный штамп для вырезания лунок, пастеровские пипетки или трубочки дляотсасывания агара из лунок, микропипетки.

Техника определения. 12 мл предварительно разогретого до жидкого состояния 1% раствора прозрачного агара, приготовленного на 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,0 - 7,2), наливают на стеклянные пластины или чашки Петри. Через 30 - 40 минут в застывшем агаре вырезают специальным штампом контуры лунок. Агар из лунок отсасывают пастеровской пипеткой или с помощью трубки, диаметр которой меньше диаметра трубочек штампа.

Препараты моноспецифической кроличьей антисыворотки против АФП человека и АФП человека растворяют соответственно в 1 и 2 мл физиологического раствора.

В центральную лунку наливают моноспецифическую кроличью антисыворотку против АФП человека (АТ), в две периферические противоположные другдругу лунки – стандартный раствор АФП человека (АГ), в оставшиесячетыре лунки – исследуемые сыворотки крови человека и физиологический рас- твор (ФР) дляконтроля (рис.2).

АГ ФР АТ 2 ФР АГ Рис. 2. Схема постановки опыта Оценка результатов.

Учет результатов осуществляетсяпо плюсовой шкале. Реакция считается положительной, если линия преципитации между стандартными компонентами иммунодиагностикума (антителами моноспецифической кроличьей антисыворотки против АФП человека и антигеном АФП человека) сливаетсяс линией преципитации, образуемой антигенами испытуемой сыворотки и антителами моноспецифической кроличьей антисыворотки против АФП человека (рис.3 б, в, г).

АГ АГ ФР ФР АТ а) АТ б) ФР ФР АГ АГ АГ АГ ФР ФР в) г) АТ АТ ФР ФР АГ АГ Рис. 3. Типы возможных результатов преципитации Обозначения:

АТ - кроличья моноспецифическаяантисыворотка против альфа – фетопротеина человека;

АГ – альфа – фетопротеин;

ФР – физиологический раствор;

1, 2, 3, 4– исследуемые сыворотки крови человека;

а) (+) – слабоположительнаяреакция;

б) (++) - положительнаяреакция;

в) (+++) - резкоположительнаяреакция;

г) (-) – отрицательнаяреакция.

В зависимости от места нахождения полос преципитации реакцию считают:

1. Слабоположительной (+) - линия преципитации находитсяу лунки с испытуемой сывороткой, концентрация альфа – фетопротеина в сыворотке менее 50 мг/мл (рис.3 а);

2. Положительной (++) - линия преципитации находитсяна одинако вом расстоянии от центральной лунки, концентрация АФП в исследуемой сыворотке 50 мг/мл (рис.3 б );

3. Резкоположительной (+++) - линия преципитации испытуемой сыворотки диффузна и сдвинута в сторону центральной лунки, а линия преципитации иммунодиагностикума резко обрывается (рис.3 в).

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.