WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     || 2 | 3 |
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Иммунология Практикум Специальность (011600)-Биология 020201 ВОРОНЕЖ 2006 2 Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета 16сентября 2005 г (протокол № 5) Составители: Путинцева О.В, Артюхов В.Г Практикум по иммунологии подготовлен на кафедре биофизики и биотехнологии биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.

Рекомендуетсядлястудентов IV курса дневного и V курса вечернего отделений биолого-почвенного факультета, специальность 011600 – Биология.

3 СОДЕРЖАНИЕ ТЕМА: РЕАКЦИИ АНТИГЕН-АНТИТЕЛО 4 1. Реакции агглютинации 5 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА I. Определение резус-фактора RhоD с помощью стандартного универсального антирезусного реа- гента экспресс - методом в пробирке без подогрева 6 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 2. Исследование сыворотки крови человека на наличие неполных резус-антител с помощью реакции конглютинации с применением желатина (в пробирках) 7 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 3. Определение титра неполных резус – антител в сыворотке крови человека 9 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 4. Определение титра - и - агглютининов (нормальных антител) в сыворотке крови человека 10 П. Реакции преципитации 12 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 5. Полуколичественноеопределе- ние альфа - фетопротеина в сывороткекрови человека методом двой- ной иммунодиффузии в геле 13 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 6. Определение содержания имму- ноглобулинов в сыворотке крови человека методом простой ради- альной иммунодиффузии по Манчини в модификации Стефани 16 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 7. Определение поверхностного антигена гепатита В (НВSАg) методом встречного иммуноэлек- трофореза в геле 19 СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 22 4 ТЕМА: РЕАКЦИИ АНТИГЕН-АНТИТЕЛО Реакции взаимодействия антител с антигенами являютсяосновополагающими в работеиммунной системы организма человека. In vitro данные реакции лежат с основе многих иммунологических методов и широко используются в лабораторной диагностике. Они позволяют с помощью высокоспецифичных антител идентифицировать количественно определять или выделять интере, сующие исследователя антигены сыворотки крови, а также антигены, находящиеся на поверхности иммунокомпетентных клеток, клеток любых тканей и органов человека, чужеродных бактерий и вирусов.

Реакции антиген-антитело часто называют серологическими, или гуморальными. Это реакции специфического связывания антигена с соответствующим ему антителом, которые приводят к образованию иммунного комплекса.

Взаимодействие антиген-антитело осуществляется по принципу трехмерной пространственной комплементарности наружных электронных облаков паратопа антитела и эпитопа антигена. Связи, возникающие между последними, обусловлены слабыми электростатическими и вандерваальсовыми силами, водородными и гидрофобными взаимодействиями, поэтому комплекс АГ-АТ не прочен, легко диссоциирует на исходные компоненты.

Взаимодействие антигена (АГ) с антителом (АТ) подчиняетсяпринципам бимолекулярной реакции и может бытьописано следующим уравнением:

k.АТ, АГ + АТ АГ k гдеАГАТ - иммунный комплекс антиген-антитело, а К1 и К2 – соответственно, константы скоростей ассоциации и диссоциации данного комплекса.

Согласно закону действующих масс в условиях равновесия константа ассоциации Ка (в иммунологии ее часто называют сродством или аффинностью) будет равна:

К1 [АГ АТ] Ка = =, К2 [АГ][АТ] где [АГАТ], [АГ] и [АТ] - соответственно молярные концентрации комплекса антиген-антитело, свободного антигена и свободного антитела.

Аффинность имеет размерностьл/моль, является величиной постоянной при определенных условиях эксперимента (рН, температура и др.). Она связана со свободной энергией взаимодействия антигена с антителом F следующим соотношением:

F = - RT ln Ка, где R-универсальнаягазоваяпостоянная (I,987 кал/Кмоль), Т - абсолютнаятемпература в градусах Кельвина.

При образовании комплекса АГ АТ изменение свободной энергии реакции зависит от теплового эффекта реакции (энтальпии Н ) и от изменения энтропии S (степени неупорядоченности системы):

F = Н - ТS.

Обычно реакции взаимодействия антигена с антителом сопровождаются выделением небольшого количества теплоты, изменением величины Н (40 кДж/моль), уменьшением упорядоченности системы, т.е. возрастанием величины S.

Константа ассоциации изменяетсяв зависимости от температурных условий реакции следующим образом:

d lnKa H = d (1/T) R Сродство антигена и антитела уменьшаетсяс повышением температуры, если в образовании иммунного комплекса принимают участие в основном водородные или полярные связи. Когда появление комплекса связано с гидрофобными и неполярными взаимодействиями, аффинностьпрактически не зависит от температуры.

Факт взаимодействия антигена с антителом можно установитьна основании ряда реакций и феноменов, важнейшими из которых являютсяреакции агглютинации, реакции преципитации, реакции опсонизации и фагоцитоза, нейтрализации токсинов, а также с помощью иммунохимических методов (иммунофлуоресценции, радиоиммунного метода, иммуноферментого анализа), использующих меченные антигены или антитела.

1. Реакции агглютинации Агглютинация - это реакция склеивания и агрегации нерастворимых частиц, нагруженных антигеном, под действием специфических антител (агглютининов). Такими частицами могут бытьклетки крови (тромбоциты, лейкоциты, эритроциты), бактерии, сперматозоиды, имеющие на своей поверхности естественные, природные антигены, а также инертные частицы (полистироловый латекс, бентонит), которые специально нагружают интересующими исследователяантигенами.

Продукты, образующиесяв результатеэтой реакции, называютсяагглютинатами. Если носителями антигенов являются эритроциты, то наблюдаемая реакция носит название гемагглютинации.

Реакция агглютинации протекает в две фазы.

В первой фазе происходит специфическаяадсорбция антител на поверхности клеток или частиц, несущих соответствующие антигены. Во второй фазе образуютсяагрегаты (агглютинаты), они выпадают в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия).

Механизм реакции агглютинации описывается теорией «решетки». Согласно этой теории агглютинат образуется при соединении одного активного центра АТ с детерминантной группой другого антигена. Избыток или недостаток антител тормозит проявление реакции агглютинации. Реакция агглютинации недостаточно специфична и чувствительна.

Различают прямую (простую) и непрямую (пассивную) агглютинацию.

При прямой агглютинации антитела реагируют с детерминантами антигенов самих частиц (антиген является структурным компонентом поверхностной мембраны частицы). При непрямой агглютинации антитела взаимодействуют с растворимыми антигенами, которые предварительно адсорбируютсяили химически соединяютсяс мембранами нативных эритроцитов. В этом случаеэритроциты являютсяпассивными носителями антигенов. Непрямая агглютинация отличаетсявысокой чувствительностью - 0,003 мкгазота белка антител в 1 мл сыворотки.

Данная реакция широко используется в лабораторной практике, где ее осуществляют как в пробирках, так и на плоскости (на специальных пластиковых планшетах и панелях длямакро- и микротитрования). Реакция агглютинации может бытькачественной и количественной. Она применяетсядлявыявления наличия или отсутствия в исследуемом объекте того или иного антигена или антител к соответствующему антигену, дляопределения титра агглютининов; длятипирования и титрования эритроцитарных антигенов систем резус и АВО или антигенов гистосовместимости; для идентификации возбудителей инфекционных заболеваний, а также для стандартизации выпускаемых иммунобиологических препаратов.

Реакция агглютинации может происходитьв организме. Примером может служить развитие хорошо известной всем реакция несовместимости, наблюдаемой у реципиентов при иногруппной трансфузии (переливании) донорской крови.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА I.

Определение резус-фактора RhоD с помощью стандартного универсального антирезусного реагента экспресс - методом в пробирке без подогрева.

Резус-фактор или резус-антиген RhоD содержитсяв мембранах эритроцитов человека и обезьян макака-резус. Он был обнаружен в крови людей К. Ландштейнером и сотр.(1940) с помощью сыворотки животных, иммунизированных эритроцитами макака-резус. Позже было установлено, что в крови людей содержитсяне только данный антиген, а система из шести антигенов ре зус. Дляих обозначения используетсядвойнаяноменклатура: RhоD, rhC, rhE, Hrоd, hrc, hre. Наибольшее значение в изоиммунных реакциях имеет антиген RhоD, так как он высокоиммуногенен, вызывает более сильную трансфузионную реакцию у несовместимого по резус – фактору реципиента, чем другие антигены системы резус. Лица, в крови которых содержитсяданный антиген, условно принято считать резус-положительными, а лица, не содержащие его, - резус-отрицательными. Среди европейского населения – 85%, а среди монголоидов – 99 % являютсяносителями антигена RhоD. По своей химической природе - это липопротеид, нерастворимый в воде, легко разрушающийсяпри гемолизе эритроцитов и термостатировании при высокой температуре Образо.

вание антигенов системы резус контролируетсятремя парами аллельных генов (Dd, Cc, Ee), которые расположены на двух хромосомах. Каждая хромосома содержит только три гена из шести, при этом лишь один из каждой пары: D или d, С или с, Е или е эритроцитах человека они могут даватьсамые разно. В образные сочетания, всего возможно 27 разновидностей генотипа.

Необходимое оборудование: универсальный реагент антирезус RhоD, стандартные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты дляконтроля, пробирки, пипетки Пастера, физиологический раствор NaCl.

Универсальный реагент антирезус RhоD из сыворотки крови резусотрицательных доноров, предварительно специально проиммунизированных антигеном RhоD и выработавших активные неполные антиэритроцитарные ре зусные антитела с титром не ниже I:32. Дляулучшения реакционных свойств донорскую сыворотку смешивают в определенных соотношениях с 33% раствором полиглюкина.

Для определения резус-фактора может быть использована свежая не свернувшаяся кровь, взятая из пальца непосредственно перед исследованием или консервированная кровь, без всякой предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки с кровью после образования сгустка и отстаивания сыворотки.

Техника определения: На дно пробирки внести одну каплю универсального реагента антирезус RhоD и одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Содержимоепробирки перемешатьвстряхиванием и затем медленно поворачивать, наклоняя пробирку почти до горизонтали таким образом, чтобы содержимое растекалось по ее стенкам. Такое размазывание крови по стенкам пробирки делает реакцию более выраженной. Как правило, агглютинация наступает в течение первой минуты, но дляобразования устойчивого комплекса (антиген + антитело) и четко выраженной агглютинации, а также ввиду возможности замедленной реакции при слабо выраженной агглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентом при вращении пробирки следует проводитьне менее 3 минут. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавить 2-3 мл физического раствора NaCl и перемешать, не взбалтывая, 2-3 раза перевернув пробирку вверх дном. Оценку ре акции производитьвизуально.

Одновременно с исследованием опытного образца крови производится контрольноеисследование стандартных резус-положительных эритроцитов той же группы или группы О(I) по системе АВО и стандартных резусотрицательных эритроцитов обязательно одногруппных с исследуемой кровью.

Оценка результата: Наличие агглютинации в видекрупных хлопьев эритроцитов на фоне просветленной жидкости указывает на резус-положительную принадлежностьисследуемой крови RhоD(+).

Отсутствие агглютинации (в пробирки гомогенно окрашеннаяжидкость) указывает на резус-отрицательную принадлежностьисследуемой крови RhоD(-).

Результат учитываетсякак истинный послепроверки контрольных образцов, т.е. при положительном результате со стандартными резусположительными эритроцитами и отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, одногруппными с исследуемой кровью по системе АВО.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 2.

Исследование сыворотки крови человека на наличие неполных резусантител с помощью реакции конглютинации с применением желатина (в пробирках).

В организме человека в норме резусные антитела отсутствуют. Они появляютсяв крови резус-отрицательной лиц (генотип dd) только в результатевведения в организм резус – положительной крови (генотип DD или Dd), а также при резус - конфликте.

Резус-конфликт – это ситуация, возникающаяпри беременности женщи ны, эритроциты которой не экспрессируют антиген D системы групп крови ре зус (резус-отрицательной матери), резус-положительным плодом. При первой беременности такого рода происходит сенсибилизация матери антигеном RhoD и образование антиRhоD - антител. При повторной беременности накопившиеся антитела проникают в организм плода и вызывают повреждение его клеток.

Таким образом, резусные антитела возникают в организме человека только в результатеиммунизации резус - антигенами. В связи с этим резусные антитела называют изоиммунными.

Определение резус - антител наряду с определением резус – принадлежности больного или донора необходимо дляпредупреждения переливания резус – несовместимой крови, а также длядиагностики возможного заболевания плода или новорожденного гемолитической болезнью.

Резус–антитела бывают разные по специфичности: анти-Rhо(D), антиrh(C), анти-rh(E), анти-hr(c), анти-hr(e), а по форме: полные и неполные.

Специфичность антител определяется тем, с каким из резус – антигенов они реагируют. Форма антител зависит от того, каким образом они реагируют с эритроцитами, содержащими специфические дляних резус – антигены.

Полные (бивалентные) антиэритроцитарные резус-антитела относятся к классу иммунолобулинов М (IgМ), имеют большую молекулярную массу (900кДа), с трудом проникают через поврежденную плаценту, обладают способностью склеиватьрезус – положительные эритроциты в пробиркебез какойо либо предварительной обработки, выявляются в солевой среде при 37 С, встречаютсяредко и имеют меньшее значение в трансфузиологической практике, чем неполные антитела.

Неполные (моновалентные) антиэритроцитарные резус – антитела относятсяк классуиммуноглобулинов, G (IgG) с молекулярной массой равной 150 – 170 кДа, они свободно переходят через плаценту, в результатечего плод получает материнские антитела. Взаимодействие данных антител с RhоD-антигеном эритроцитов плода приводит к разрушению последних фагоцитами и возникновению у новорожденных гемолитической болезни (ГБН). In vitro неполные ре зус – антитела фиксируютсяна мембранах резус –положительных эритроцитов, не вызываяих склеивания. Объясняетсяэто низкой плотностью антигена RhоD на поверхности эритроцитов, что препятствует образованию достаточного количества связей, необходимых дляпреодоления электростатических сил отталкивания между отрицательно заряженными мембранами отдельных эритроцитарных клеток. Неполные резус–антитела агглютинируют эритроциты только в присутствии коллоидных растворов (желатин, полиглюкин, альбумин) или под действием специально приготовленной антииммуноглобулиновой сыворотки (сыворотка Кумбса).

Известно, что риск развития ГБН вследствие резус – несовместимости уменьшается, если у отца и матери группы крови системы АВО различные. В таких случаях в организме RhоD(-)-матери клетки RhоD(+) эритроцитов разрушаютсябыстрее, поскольку они несовместимы и по антигенам системы АВО. В результатеорганизм матери не успевает сенсибилизироваться. Отсюда возникла идея резус – профилактики. Сразу послерождения резус - положительного ребенка резус - отрицательной матери не более, чем через 72 ч. вводят антирезусные антитела. Они разрушают попавшие в ее кровь RhоD(+) зусные антитела. Они разрушают попавшие в ее кровь RhоD(+)-эритроциты плода прежде, чем последние смогут оказатьсенсибилизирующее действие. Таким образом удалосьзначительно снизитьчастоту ГБН и смертностьноворожденных, обусловленную резус – несовместимостью.

Необходимое оборудование: исследуемая сыворотка крови человека, кровь дляприготовления стандартных эритроцитов, пробирки, пипетки Пастера, 10% раствор желатина, водянаябаня или суховоздушный термостат, физиологический раствор, секундомер, микроскоп.

Техника определения.

а) Приготовление стандартных эритроцитов.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.