WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 11 |

При этом в наружной цепи кольцевой двойной спирали ДНК хромосомы бактерии возникает разрыв, который происходит с помощью фермента эндонуклеазы, узнающего специфический участок ori. При разрыве появляются свободные однонитевые концы 5 и 3. Освободившийся 5конец прикрепляется к клеточной мембране. Материнская кольцевая молекула вращается против часовой стрелки, при этом наружная цепь (“плюс нить”) как бы “сползает” с внутренней (“минус нити”). В точке разрыва возникает репликационная вилка. Одна новая дочерняя цепь ДНК синтезируется как продолжение внешней, используя в качестве матрицы неразорванное внутреннее кольцо. Нуклеотиды присоединяются к 3-концу этой цепи, синтез дочерней цепи идет в направлении 53. По мере вращения кольцевой молекулы величина развернувшейся наружной цепи от 5-конца увеличивается. Эта цепь служит матрицей для синтеза второй дочерней цепи. Синтез на ней идет также в направлении 53. Т.е. кольцевая родительская молекула превращается в две дочерние молекулы, одна из которых кольцевая, а другая – линейная. Промежуточная структура имеет формусигма (). Линейная нить, содержащая несколько повторов одного и того же генома, называется конкатемер. Из него молекулы, равные по длине хромосомы, вырезаются ферментами рестриктазами, узнающими короткие блоки специфических последовательностей оснований в ДНК. Такой способ репликации обусловливает образование многих копий материнской ДНК. Этот тип репликации имеет место при половой конъюгации бактерий (перенос ДНК от донора к реципиенту через конъюгативный мостик), встречается в оогенезе некоторых эукариотических организмов.

Рисунок 5. Репликация по типу“катящегося кольца” Репликация ДНК у бактерий может осуществляться по -типу (тэтатипу) (рисунок 6). В этом случае сохраняется кольцевая структура молекул ДНК. В противоположных направлениях от локуса ori движутся две репликативные вилки до тех пор, пока снова не встретятся. Движение двух репликативных вилок приводит к образованию “глазков”, расширяющихся в двух направлениях вдоль хромосомы по мере репликации. Промежуточная структура напоминает греческую букву. Такой тип репликации превращает родительскую кольцевую хромосому в две дочерние кольцевые хромосомы, в каждой из которых сохраняется одна из цепей родительской молекулы, а вторая цепь заново синтезируется. Вначале 2-х цепочечные кольцевые молекулы связаны с друг другом. При их разделении одно из двух колец временно разрывается.

Рисунок 6. Схема репликации кольцевых молекул ДНК при сохранении кольцевой структуры ( -тип) 1.3.1.3. Амплификация генов рРНК у эукариот По типу“катящегося кольца” происходит также амплификация (т.е.

увеличение числа копий генов, количества ДНК) экстрахромосомных копий рДНК, ответственной за синтез рРНК в эукариотической клетке. Так, ооцитам амфибий после оплодотворения необходим усиленный синтез рибосом, чтобы обеспечить белком ранние этапы развития зиготы, т.е. процесс дробления, поскольку синтеза ДНК, а следовательно, ее транскрипции и трансляции при дроблении не происходит. В этом случае одна из копий рДНК, содержащая многократные повторы генов, кодирующих рРНК, покидает хромосому (а именно, район ядрышкового организатора), а затем многократно реплицируется (или амплифицируется) по типу “катящегося кольца”. В результате возникает масса свободных ядрышек, структурно не связанных с ядрышкообразующими хромосомами, происходит усиленный синтез рибосом (образуется до 1012 рибосом за один клеточный цикл вместо до 107 рибосом в норме), а следовательно, и белка. Такая дифференци альная репликация отдельных участков ДНК находится под генетическим контролем и возможна благодаря полирепликонной структуре эукариотической хромосомы. Амплификация может быть и аномальным явлением и выступать в качестве одного из механизмов активации онкогенов в процессе развития опухоли, сомаклональной изменчивости клеток и тканей в условиях культуры in vitro и др.

Репликация катализируется полиферментным комплексом, связанным с ДНК в виде реплисомы. Благодаря слаженному взаимодействию всех ферментов, составляющих комплекс, репликация происходит с фантастической скоростью: 1000 нуклеотидов в сек у прокариот и 100 – у эукариот (из-за их связи с белками гистонами).

1.3.1.4. Механизм репликации ДНК. Репликационная вилка Рассмотрим, как происходит репликация линейной молекулы ДНК.

Для того чтобы каждая из двух цепей ДНК стала матрицей для синтеза новой цепи, необходимо, чтобы нити ДНК расправились, или релаксировали. Ферменты класса топоизомераз (ДНК-гираза) удаляют супервитки спирали.

Началом репликации служит разворачивание дуплексной ДНК при катализе ферментом геликазой. Постепенное расплетение молекулы ДНК происходит при разрыве водородных связей между пуринами и пиримиди нами. Образующаяся одноцепочечная ДНК сразуже “защищается ” от деградации связыванием белков SSB. Благодаря действию этих белков на ДНК (белки предотвращают обратное воссоединение комплементарных пар оснований) образуется участок локальной денатурации и две вилки, в которых в дальнейшем происходит репликация. Причем, как показали электронномикроскопические исследования, репликация начинается не с конца линейной молекулы, а в виде “глазков” по длине молекулы.

Возникающие однонитевые участки становятся матрицами для притяжения из цитоплазмы комплементарных нуклеотидов. Поскольку нити двойной спирали ДНК антипараллельны, в репликационной вилке присутствуют 5 и 3-концы. Однако синтез ДНК может идти только в направлении от 5 к 3-концу. На одной цепи, получившей название лидирующей, синтез ДНК идет непрерывно в направлении 53. Но не сразу удалось понять, как же синтезируется другая цепь, названная отстающей. Разгадать эту загадку удалось японскому ученому Р. Оказаки, проследившему за судьбой вновь синтезированной ДНК, получившей очень короткую метку радиоактивности. Метка поступала в ДНК, имеющую вид коротких фрагментов - фрагментов Оказаки. Длина фрагментов у прокариот составляет 1000-2000 нуклеотидов, у эукариот – 100-200 нуклеотидов. Таким образом была доказана прерывистая репликация ДНК на отстающей цепи. Дочерняя цепь на ней синтезируется в виде коротких фрагментов с обычной 53 полярностью при их последующем объединении, обеспечивающим рост отстающей цепи. Схема репликации представлена на рисунке 7.

Синтез дочерних цепей направляется ДНК-полимеразой. В клетках E. coli обнаружено 3 типа ДНК-полимераз: I, II и III. Основным ферментом при синтезе новой нити ДНК является ДНК-полимераза III. Однако она не способна инициировать синтез дочерних полинуклеотидных цепей. Эту роль выполняет фермент РНК-полимераза (праймаза), которая узнает место инициации и от него на матричных нитях ДНК начинает синтез короткой молекулы РНК-затравки (праймера), состоящей из 50-100 нуклеотидов. ДНК-полимераза II обусловливает начало синтеза нити ДНК с конца затравочной молекулы РНК. Наращивание молекулы в длину осуществляет ДНК-полимераза III. При естественном процессе репликации наращивание цепи ДНК останавливается по стоп-сигналу исходящему из матрич, ной цепи. Так образуются фрагменты Оказаки. ДНК-полимераза I удаляет праймеры и обеспечивает заполнение освободившихся участков (брешей) соответствующими нуклеотидами, комплементарными ДНК-матрице.

Сшивание фрагментов Оказаки осуществляется с помощью ДНК- лигазы.

Этот фермент восстанавливает фосфодиэфирную связь между одноцепочечными разрывами в молекуле ДНК.

Лидирующая цепь Белок SSB РНК-праймер Фрагменты Оказаки ДНК-гираза геликаза 5 Отстающая цепь Рисунок 7. Строение репликационной вилки (Объяснение в тексте) 1.3.1.5. Особенности репликации концевых участков линейных молекул ДНК эукариот. Теломеры и теломераза Молекулярно-биологические процессы, происходящие во время репликации ДНК, в основном сходны у эукариот и прокариот. Тем не менее, существуют и различия. Если бактериальная хромосома – один репликон, то хромосома эукариот полирепликонна и по ней в каждый момент времени может двигаться независимо друг от друга множество репликационных вилок. Остановка продвижения вилки происходит только при столкновении с другой вилкой, или по достижении конца хромосомы.

Кроме того, у линейных молекул ДНК (в отличие от кольцевых молекул) существует проблема “концевой недорепликации”. Дело в том, что все известные ДНК-полимеразы неспособны полностью реплицировать концы линейных ДНК. Поэтомупропуск, образовавшийся после удаления крайнего праймера на 5-конце дочерней цепи ДНК, заполнен быть не может. В результате выступающие 3-концевые участки материнской цепи ДНК остаются однотяжевыми, а их 5- концевые участки - недореплициро – ванными (рисунок 8). Каждый раунд репликации хромосом будет приводить к их укорочению на 50-60 и более нуклеотидов. Считается, что теломеры являются нашими молекулярными часами, поскольку они укорачиваются с каждым клеточным делением. Теломеры – концевые участки хромосом эукариот, состоящие из многократно повторяющихся коротких нуклеотидных последовательностей (у позвоночных – TTAGGG), связанных с белками. К настоящемувремени известно, что теломерные повторы у большинства живых существ очень схожи.

3 5 удаление праймера 3 5 выступающий конец добавление теломерных повторов к 3-концу теломеразой 3 5 •••••• “дорепликация” дочерней цепи по матрице удлиненной цепи 3 5 Рисунок 8. Схема репликации концевого участка отстающей цепи ДНК.

Изображен один из концов хромосомы, другой удлиняется аналогичным способом Первым на проблему “концевой недорепликации ДНК” обратил внимание А.М. Оловников в 1971 г. Он предположил, что потеря концевых последовательностей ДНК вследствие их недорепликации ведет к старению клетки, т.е. он предлагал рассматривать процесс укорочения теломер как тот “часовой механизм”, который определяет “репликативный потенциал” смертной клетки. Причину гибели клеток он усматривал в том, что при постоянной недорепликации и укорачивании хромосомы сначала исчезают теломерные районы, затем ближайшие к теломерам гены, потом более удаленные гены и т.д. Оловников предположил также, что в нестареющих клетках (к ним, кроме раковых, относятся еще зародышевые, стволовые и генеративные клетки ) должна существовать специализированная ферментативная система, которая контролирует и поддерживает длину теломерной ДНК. Гипотеза Оловникова получила убедительное подтверждение в 90-е годы, когда был открыт фермент теломераза. С помощью этого фермента 3-концы ДНК хромосом эукариот наращиваются перед каждым раундом репликации короткими (6-8 нуклеотидов) повторяющимися последовательностями. Образующиеся длинные одноцепочечные концы, в свою очередь, служат матрицей для “дорепликации” концевых участков дочерней цепи (т.е. восстановления полноразмерных теломер). При этом репликация идет в обычном порядке: на добавленном теломерном повторе синтезируется концевой праймер, а затем происходит “дорепликация” 5-концевого участка, в результате чего дочерняя цепь становится той же длины, что и родительская. Уникальность теломеразы состоит в том, что помимо белковой части она содержит РНК, выполняющую роль матрицы для наращивания ДНК повторами. Это дает основание отнести теломеразу к обратной транскриптазе, т.е. ферменту способному, вести синтез ДНК по матрице РНК. У человека теломераза активно функционирует в эмбриональных тканях, в стволовых и половых клетках.

При дифференциации зародышевых или стволовых клеток активность теломеразы падает и теломеры укорачиваются. По достижении критической длины теломерной ДНК запускаются процессы остановки клеточного цикла. Дифференцированные, смертные клетки делятся ограни ченное число раз. Так, клетки новорожденных в культуре делились 80-раз, клетки 70-летнего старика – 20-30. Это явление получило название лимита Хейфлика по имени открывшего его в 1960 г. автора. Далее клетки дряхлеют и гибнут. Но в январе 1998 г. средства массовой информации во всем мире буквально взорвались сообщениями о том, что американским ученым удалось заставить клетки человека преодолеть “лимит Хейфлика” почти вдвое. При этом они не трансформировались в раковые, а оставались нормальными. В газетах появились статьи с сенсационными заголовками “Генетики уткнулись в бессмертие”; “Лекарства от старения будутдоступны как аспирин”, “Таблетки от старости станутреальностью” и т.п. Так средства массовой информации интерпретировали результаты опытов ученых, которые вносили ген теломеразной активности в соматические клетки, предотвращая тем самым укорочение теломер, а следовательно, и старение клеток. Но укорочение теломер – не единственный фактор, определяющий старение организмов, что вряд ли можно повернуть вспять. Но вполне реальна возможность активации теломеразы в клетках кожи, пересаживаемой пациентам с сильными ожогами, клеток сетчатки глаз для ее омоложения у пациентов с помутнением сетчатки (это заболевание широко распространено у пожилых людей и ведет к слепоте). Введение в раковые клетки препаратов, связывающих РНК-компонент теломеразы, приводит к укорочению теломер с последующей гибелью клеток, вселяя надежду на появление новых средств борьбы с раком.

1.3.2. Транскрипция Репликация ДНК отвечает за воспроизведение генетической информации, в том числе и мутаций, если они произошли в одной из цепей ДНК.

Реализация же генетической информации осуществляется в ходе ее считывания (т.е. в ходе транскрипции) и перевода этой информации в структуру молекулы белка (т.е. в ходе трансляции). Поток генетической информации в этом случае идет в направлении ДНКРНКбелок. Оба эти процесса составляют суть матричной активности генов и осуществляются при участии молекул посредников, т.е. разных типов РНК, строящих свои копии по матрице ДНК.

Транскрипция – это считывание (“переписывание”) генетической информации с соответствующего гену участка двухцепочечной ДНК на одноцепочечную молекулу информационной РНК (иРНК), или матричную РНК (мРНК), или как ее еще называют messenger РНК. Транскрипция во многом сходна с репликацией. В отличие от репликации ДНК синтез РНК (транскрипция) идет не на всей ДНК-матрице, а на определенном ее участке, где располагается структурный ген соответствующего белка (или тРНК, рРНК) или группа функционально сходных генов. Т.е. транскрибируются не все, а отдельные гены, потребность в продукте которого (или которых) появилась в настоящий момент. Каждомуработающемугену (или группе генов) соответствует своя молекула мРНК. ПоэтомумРНК - крайне гетерогенный по размерам и нуклеотидной последовательности класс молекул.

Считывание генетической информации происходит с участка одной цепи, получившей название матричной (смысловой). Вторая цепь, последовательность нуклеотидов в которой совпадает с последовательностями мРНК, называется кодирующей (или антисмысловой). Выбор транскрибируемой цепи определяется ориентацией промотора. РНК синтезируется в направлении от 5- к 3- концу.

Таким образом, с молекулярной точки зрения ген представляет собой специфическую нуклеотидную последовательность, транскрибируемую в РНК. Это так называемые структурные гены, конечным продуктом которых являются белки.

Чтобы обеспечить транскрипцию только отдельных сегментов ДНК, должны существовать некие сигнальные последовательности, указывающие, где начинается (инициируется) транскрипция – промотор и где она останавливается (терминируется) - терминатор. Сигналы инициации обычно располагаются перед кодирующей последовательностью (5фланкирующая последовательность), а терминации – после (3фланкирующая последовательность).

Участок ДНК, ограниченный промотором и терминатором, представляет собой единицу транскрипции - транскриптон. У эукариот в состав транскриптонов входит, как правило, только один ген, а у прокариот транскриптоны полицистронны и часто содержат несколько функционально связанных генов, организованых в опероны. Поэтомусинтезируемая на оперонах мРНК является полицистронной и может быть использована для синтеза нескольких белков, в отличие от моноцистроновых мРНК эукариот, служащих матрицей для одного определенного белка.

В транскрипции, как и в других матричных процессах, различают этапа: инициацию, элонгацию и терминацию. Инициацию транскрипции осуществляет фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза, или просто РНКполимераза, путем присоединения к определенной стартовой точке (промотору), который находится в начале гена или группы функционально связанных генов.

У прокариот единственная РНК-полимераза, состоящая из четырех субъединиц (2), синтезирует все типы РНК: мРНК, тРНК и рРНК.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 11 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.