WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 |

Кроме того, установлено, что в клеточном цикле есть несколько точек контроля = точек проверки (check-points), в которых обеспечивается контроль при переходе клетки G1S, G2M и от метафазы к анафазе митоза. В этих пунктах действуют так называемые “полицейские гены” (все они получили имя rad, к которомудобавляется порядковый номер, например, rad51), продукты которых (rad-белки ) организуют тщательную проверку целостности генетического материала и готовность к переходу в следующую стадию цикла. Если в клетке повреждена ДНК и синтезируются не те белки, которые должны синтезироваться на данном этапе, в клетку поступает сигнал, блокирующий ее переход в следующую фазу. При обнаружении слабых дефектов (“ошибок”) включается система репарации для восстановления повреждений ДНК. Если же повреждения ДНК значительны и репарация не происходит, клетка либо самоуничтожается с помощью процесса апоптоза (генетически программируемой смерти клетки ), либо вступает далее в аберрантное деление. Т.е. “точки контроля” клеточного цикла представляют собой механизм, который предохраняет делящиеся клетки от летального митоза.

Индукция апоптоза является важнейшей функцией гена р53. При существенных нарушениях ДНК происходит накопление белка р53, концентрация которого в норме очень низкая. Этот белок является одним из факторов транскрипции, стимулирующих синтез белка р21, являющегося ингибитором образования комплекса cyc/cdk, что приводит к остановке клеточного цикла на стадии G1 или G2. Клетки с блокированным клеточным циклом уничтожаются путем апоптоза. При мутации гена р53 блокады клеточного цикла не происходит. Клетка вступает в митоз, что приводит к появлению мутантных клеток, большая часть из которых нежизнеспособна, другая – дает начало злокачественным клеткам.

Считают, что эти открытия будутприменяться при диагностике опухолей и приведут к разработке новых способов борьбы с раком, т.к. у большинства известных типов опухолевых клеток нарушено регуляция клеточного цикла. Причем, в каждой опухоли по-своему Так, в одних.

клетках слишком много циклинов, поэтомуони делятся быстрее обычного, у других – отключены гены группы rad “полицейские гены”, в результате чего выходят из строя “точки контроля” и клетка, игнорируя накопившиеся патологии, вступает в митоз и др.

Тема 3. РЕПАРАЦИЯ ДНК Мы уже говорили о том, что существуют 4 фундаментальных процесса жизнедеятельности клетки : репликация, транскрипция, трансляция и репарация. Репарация – это исправление самой клеткой при участии ферментов повреждений, возникающих в ДНК. При этом происходит восстановление нативной (первичной) структуры молекулы ДНК.

Репликация (копирование генетической информации) происходит с высокой точностью. Однако и в ДНК возникают различные повреждения при действии на организм факторов внешней (УФ-облучение, ионизирующая радиация, химические мутагены, температура и др.) или внутренней среды, способных вызывать спонтанный или индуцированный мутагенез.

Мутации могли бы возникать в природе чаще и приводить к катастрофическим последствиям для многих видов, и в том числе для человека, если бы не способность ДНК к репарации возникающих повреждений.

Повреждения ДНК могутиметь характер изменения ее химического состава за счет ошибочного включения при репликации некомплементарного основания вместо комплементарного. В результате появляются некомплементарные пары нуклеотидов – мисмэтчи. Это может произойти, например, при: 1) апуринизации - потери пуриновых оснований – A или G, вследствие чего образуется “апуриновая брешь”, на место которой может встроиться другое основание; 2) дезаминировании - т.е. отщеплении аминогруппы от азотистых оснований – G, C или T, что может происходить спонтанно или под действием азотистой кислоты. При дезаминировании цитозина (который в норме спаривается с гуанином) образуется урацил (U), который уже спаривается с аденином; 3) алкилировании оснований под действием многих химических мутагенов (например, супермутагенов – НММ, НЭМ и др.) и канцерогенов. Так, при метилировании азотистых оснований происходит их химическое изменение и ошибочное спаривание с другими основаниями: метилированный гуанин, например, будет спари- ваться с тимином, а не с цитозином. Корректирующую роль при этом играет ДНК-полимераза I, уменьшающая число ошибочных спариваний.

Но повреждения ДНК могутбыть вызваны и изменениями ее регулярной структуры, т.е. конформации под действием, например, ультрафиолетового излучения (УФ), которое вызывает образование межцепочечных сшивок ДНК, препятствующих разделению ее цепей, а следовательно, и нормальномуосуществлению процессов репликации и транскрипции.

Удивительная стабильность генетического материала – ДНК связана не с его консервативностью, а с существованием в клетках всех живых организмов специальных систем репарации, устраняющих повреждения, возникающие в ДНК. Все они имеют ферментативную природу и исправляют только однонитевые повреждения.

Принцип работы этих механизмов основан на том, что каждая молекула ДНК содержит 2 полных набора генетической информации, записанной в комплементарных друг другу полинуклеотидных нитях ее двойной спирали. Это обеспечивает сохранение неискаженной информации в одной нити, даже если другая повреждена, и дает возможность использовать неповрежденную нить в качестве образца (матрицы ) при исправлении возникшего дефекта.

Если системы репарации не способны скорректировать повреждения, возникают мутации. Если мутаций возникает слишком много или они затрагивают жизненно важные функции, клетка погибает.

Существуют различные типы репарации ДНК. Наиболее подробно исследована репарация в УФ-облученных клетках.

УФ-излучение составляет значительную часть солнечного света. Его избыточные дозы (длиной волны 220-320 нм), которые создаются за счет разрушения озонового слоя в результате хозяйственной деятельности человека, могутвызывать образование в молекуле ДНК бактерий и клетках кожного покрова человека тиминовых димеров, т.е. их сшивку за счет образования ковалентных связей между двумя тиминами, расположенными рядом в одной из цепей ДНК или в противоположных цепях ДНК (рисунок 20).

Это изменяет структуру ДНК и нарушает ее биологическую активность. Так, димер, образовавшийся в одной цепи ДНК, не спаривается ни с одним основанием и при репликации ДНК в синтезируемой нити напротив димера остается брешь. Появление димеров приводит к локальной денатурации ДНК. Каждый тиминовый димер в ДНК E. coli задерживает репликацию на 10 сек.

Эти нарушения исправляются с помощью систем репарации. Системы репарации ДНК достаточно консервативны в эволюции от бактерий до человека, но наиболее детально изучены у E.coli и дрожжей.

УФ -излучение Тиминовые димеры Т Т а б Остов ДНК Рисунок 20. Образование тиминовых димеров при возникновении ковалентных связей между двумя соседними тиминами в одной (а) или противоположных (б) цепях ДНК.

Известны три основных механизма репарации ДНК, способные исправлять ее конформационные нарушения: фотореактивация, эксцизионная репарация, пострепликативная репарация. Фотореактивация и эксцизионная репарация относятся к дорепликативной, т.к. происходят до репликации ДНК. Эксцизионная и пострепликативная репарация, помимо этого, также репарируют неправильно спаренные или поврежденные основания.

3.1. Фотореактивация Это прямая репарация, наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК. Суть фотореактивации состоит в следующем: при действии УФ-облучения происходит сшивка тиминов, расположенных рядом в противоположных цепях ДНК (или расположенных рядом в одной цепи ДНК).

Особый фермент – фотолиаза (кодируемый геном phr) распознает димеры тимина и прочно связывается с ними сразу после их образования. Комплекс фермента с димерами образуется и остается стабильным только в темноте (с неповрежденной ДНК фермент не связывается). Под действием энергии видимого света (длиной волны 300-600 нм) фермент активизируется и разрезает димер на отдельные тимины, восстанавливая тем самым нормальную структуру ДНК, а следовательно, и ее биологическую активность.

3.2. Эксцизионная репарация При эксцизионной репарации поврежденные участки вырезаются (эксцизия = вырезание) из цепи ДНК, а затем образовавшиеся бреши заполняются новой последовательностью по матрице неповрежденной комплементарной (второй) цепи. Этот механизм способен исправлять очень разнообразные повреждения ДНК, возникающие спонтанно или вызванные действием разных физических и химических мутагенов (неправильно спаренные или поврежденные основания, образовавшиеся тиминовые димеры, однонитевые разрывы и др.).

Эксцизионная репарация – многоступенчатый процесс, протекающий при участии нескольких ферментов (в отличие от фотореактивации) и включающий следующие этапы (рисунок 21):

1) узнавание поврежденного участка цепи ДНК (например, тиминового димера – T=T). Молекулы фермента – эндонуклеазы (в частности, УФ-нуклеаза) “обследуют” молекулы ДНК и “узнают” повреждения;

2) надрезание, или инцизия поврежденной цепи ДНК (с 5-конца от повреждения) тем же ферментом. В результате этого происходит разрыв фосфодиэфирных связей;

1)2) AA AA 3) AA T=T T=T 5'3' 5'3' брешь эндонуклеаза экзонуклеаза 5) 4) AA AA TT TT ДНК-лигаза ДНК-полимераза I Рисунок 21. Схема эксцизионной репарации (пояснения в тексте) 3) вырезание (удаление), или эксцизия поврежденного участка с 3 го конца с помощью экзонуклеазы;

4) синтез новой последовательности, замещающей вырезанную (т.е.

заполнение бреши с помощью неповрежденного = интактного участка противоположной цепи ДНК). Обычно застраиваются короткие участки длиной до 30 нуклеотидов при участии ДНК-полимеразы I;

5) восстановление непрерывности репарируемой цепи с помощью ДНК-лигазы путем ковалентного связывания 3-конца вновь синтезированного участка молекулы ДНК с концом основной полинуклеотидной цепи.

Удаление тиминовых димеров из молекулы ДНК сопровождается ее внеплановым синтезом, который происходит по репаративному типу вне S-фазы клеточного цикла, аналогичного синтезув пахитене мейоза.

Различные варианты эксцизионной репарации широко распространены у про- и эукариотических организмов. Она обнаружена у простейших, в культуре клеток млекопитающих.

За последние 10 лет многие гены, участвующие в эксцизионной репарации у эукариот, изолированы (из почкующихся дрожжей, клеток млекопитающих - преимущественно грызунов и человека), клонированы и изучены. Было показано высокое структурное и функциональное постоянство этих генов у столь разных организмов и сделан вывод о том, что механизм эксцизионной репарации сходен (если не идентичен) у всех видов организмов.

3.3. Пострепликативная репарация (ПРР) Это способ быстрого восстановления нормальной (нативной) структуры части или всех дочерних молекул ДНК. Восстановление повреждений происходит после синтеза ДНК.

Если до начала репликации ДНК из нее не были устранены все дефекты, то одна из нитей материнской молекулы будет нести повреждение (димеры тимина), а комплементарная ей нить будет свободна от повреждений. На поврежденной нити репликация завершится тем, что напротив ди мера тимина в заново синтезированной нити окажется брешь, в то время как сестринская двойная спираль не будет нести повреждения. Эта брешь может быть застроена фрагментами, взятыми от неповрежденной молекулы ДНК в результате рекомбинации, т.е обмена (поэтому эту репарацию называют еще рекомбинационной), а пробелы в родительских цепях – путем репаративного синтеза, осуществляемого ДНК-полимеразой I или III.

Если нет этих ферментов, то синтез идет под действием ДНК-полимеразы II. В клетках процесс ПРР контролируется по крайней мере 17 генами.

ПРР включает следующие этапы (рисунок 22):

1) молекулы белка RecA присоединяются к зоне бреши;

2) под контролем белков RecA происходит рекомбинация – участок комплементарной цепи сестринской нити (свободный от дефектов) переносится в район бреши. Для этого с помощью белка RecA из комплементарной цепи вырезается участок ДНК, равный по длине участку бреши, и встраивается в брешь напротив димера тимина. Фермент лигаза соединяет концы вставленного фрагмента с концами нормально синтезированного участка дочерней нити;

3) Репаративный синтез: брешь, оставшаяся после вырезания участка из материнской нити, застраивается ДНК-полимеразой I и концы соединяются лигазой.

Эта система защиты ДНК свойственна всем клеткам – от бактерии до клеток высших растений, животных и человека.

3' AA TT AA 5' 5' 3' 5' репликация брешь T=T 3' 5'3' T=T 3' 5' димер тимина 1) RecA-белки T=T рекомбинация 3) AA 2) репаративный TT TT синтез AA AA T=T T=T с участием ДНК-полимеразы I и лигазы Рисунок 22. Схема пострепликативной репарации ДНК (пояснения в тексте) 3.4. SOS-репарация Разновидностью пострепликативной репарации является SOSрепарация. Она протекает медленно (поэтомуее еще называют медленная пострепликативная репарация), для ее осуществления требуется несколько часов и восстановление первичной структуры происходит неточно. Это репарация, “склонная к ошибкам”, так как для нее характерна относительно высокая частота ошибок, возникающих при восстановлении первичной структуры ДНК. Встречается в клетках с большим числом мутаций.

Эта система включается тогда, когда повреждений в ДНК становится настолько много, что жизнь клетки поставлена под угрозу. В этом случае клетка мобилизует дополнительные ресурсы и спасает свою жизнь путем ошибок. Среди выживших клеток повышается уровень мутирования.

Сигналом для SOS-репарации являются повреждения ДНК, вызванные УФ-облучением (так, для E. coli достаточно не менее 30-60 невырезанных димеров в геноме) и другими факторами. В этом случае происходит индукция активности разнообразной группы генов, задействованных в различных клеточных процессах, сопряженных с репарацией ДНК.

SOS-репарацию осуществляют ферменты, индуцированные облучением, которые отсутствуют в необлученных клетках. Главными участниками SOS–репарации у E. coli являются белки, кодируемые генами recA и lexA. Первый из них представляет собой полифункциональный белок recA, участвующий в пострепликативной репарации, рекомбинации ДНК, в регуляции транскрипции фага, поражающего E. coli. Белок lexA является репрессором (репрессирует=выключает ген) транскрипции большой группы генов, предназначенных для репарации ДНК бактерий (в том числе гена recA).

В интактной клетке белок recA обеспечивает рекомбинацию, но его недостаточно для индукции SOS-функции. В неповрежденной клетке возможность избыточной продукции белка recA подавлена (репрессирована) белком lexA. Повреждения ДНК активируют recA – белок, который связывается с lexA- репрессором и расщепляет (инактивирует) его. Это приводит к активации генов SOS-системы, репрессоры которых тоже расщепляются белком recA. При этом индуцируется синтез белков, которые присоединяются к ДНК-полимеразному комплексу и делают возможным строить дочернюю ДНК напротив дефектных звеньев матричной цепи, подставляя любые случайные нуклеотиды, лишь бы пройти эти участки. В результате SOS-репарации клетка спасается на данном этапе: ее ДНК оказывается удвоенной, хотя и с ошибками, и теперь может произойти клеточное деление.

Но если жизненно важные функции все-таки безнадежно испорчены, такая клетка позже все равно погибнет. SOS-система репарации выявлена не только у бактерий, но и у животных и человека.

Реакция клетки на повреждение включает также замедление прохождения клеточного цикла и активацию синтеза специфических белков.

Генетическую детерминированность такого замедления прохождения клеточного цикла впервые продемонстрировали на дрожжах в 1988 г. Вейнерт и Хартвелл, назвав такое явление checkpoint –контролем или точками проверки клеточного цикла. Белки – продукты checkpoint – генов сканируют целостность ДНК и обеспечивают задержку клеточного деления в случае повреждения молекулы ДНК. При этом ферменты могутактивировать репарационные процессы или, в случае необратимых повреждений ДНК, включать апоптоз, т.е. запрограммированную смерть клетки. К белкам – продуктам checkpoint – генов относится, в частности, белок р 53 – супрессор опухолей.

Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.