WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 |

Для выявления бактерионосителей используют главным образом бактериоскопический и бактериологический методы, иногдабиопробы. Экспрессдиагностика осуществляется иммунофлюоресцентным методом.

Микробиологическая диагностика респираторных заболеваний, вызванных стафилококками, стрептококками, а также анаэробными бактериями проводится методами, которые излагаются в предыдущих темах.

Лабораторная диагностика менингококковой инфекции, коклюша и дифтерии Задания для выполнения лабораторной работы 1. Указать приспособления (виды тампонов) для взятия материала при менингококковой инфекции, коклюше и дифтерии.

2. Микробиологическое исследование при менингококковой инфекции, коклюше и паракоклюше:

а) указать материал, подлежащий исследованию;

б) бактериоскопический метод: микроскопировать готовые мазки из спинномозговой жидкости и носоглотки, сделать заключение и наметить план дальнейшего исследования;

в) бактериологическое исследование и иммунохимический метод;

г) по результатам, полученным из лаборатории, сделать заключение.

3. Микробиологическое исследование при дифтерии:

а) указать материал, подлежащий исследованию;

б) бактериоскопический метод: микроскопировать мазки из материала, взятого из зева лиц с подозрением на дифтерию илибактерионосительство, сделать предварительное заключение и наметить ход дальнейшего исследования для подтверждения бактериоскопического диагноза;

в) бактериологический метод: описать рост культуры, полученной на свернутой сыворотке, и колоний на теллуритовой среде, отметить результаты готовых посевов исследуемых культур на средах "пестрого" ряда в случае, обнаружения С.diphtheriae определить ее токсигенность. Сопоставить данные бактериоскопического и бактериологического исследований с целью идентификации выделенной культуры и поставить окончательный микробиологический диагноз.

4. Дать краткую характеристику диагностическим, профилактическим и лечебным препаратам.

Методические указания Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции Материал для исследования: спинномозговая жидкость, кровь, мазки со слизистой оболочки верхних отделов носоглотки аспират из высыпных, элементов.

При обследовании на носительство материал из верхних отделов носоглоткиберут специальным носоглоточным тампоном (который на 3/4 длины сгибают под углом 45°). При доставке в лабораторию его предохраняют от охлаждения и высушивания, поскольку менингококк очень чувствителен к воздействию этих факторов.

Спинномозговую жидкость берут в количестве 2-5 мл и делят на две части: одну центрифугируют и исследуют осадок, к другой добавляют полужидкую питательную среду и выдерживают при 37 °С для накопления бактерий. Из исследуемого материалаготовят мазкиипроизводят посевы.

Бактериоскопическое исследование (схема 8). Мазки из осадка спинномозговой жидкости окрашивают по методу Грама и микроскопируют. При наличии гноя в большинстве случаев обнаруживаются типичные грамотрицательные диплококки имеющие характерное расположение внутри, лейкоцитов, что позволяет сделать окончательное заключение о менингококковой инфекции. При микроскопии мазков из носоглоткибактерионосителей наряду с менингококком обнаруживаются грамположительные стафилококки и стрептококки а также непатогенные нейссерии (Moraxella spp. и др.).

, Дифференцировать их по морфологическим признакам затруднительно.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают петлей на чашкис питательным агаром, содержащим кровь, сыворотку крови или асцитическую жидкость. В среды добавляют антибиотик ристомицин (ЕД/мл), который задерживает размножение грамположительных кокков, содержащихся в исследуемом материале, и тем самым способствует выделению чистой культуры менингококка. Образование колоний менингококка на этих средах наблюдается через 48 ч после инкубации посевов при 37 °С в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (3-10 %) и высокой влажностью.

В отличие от других кокков колонии менингококка величиной с булавочную головку прозрачны, имеют голубоватый оттенок и ровные края.

Такие колонии пересевают в пробирку со скошенным агаром для получения чистой культуры.

Идентификацию чистой культуры, дифференциацию от сапрофитных нейссерии, обитающих в носоглотке, проводят по ряду культуральных и биохимических признаков. Так, менингококк растет только в присутствии нативного белка, в то время как другие нейссерии размножаются на простых средах иобразуют пигмент; на средах Гисса с добавлением сывороткикрови менингококк ферментирует глюкозу и мальтозу до кислоты. Фаготипирование менингококкапроводят для эпидемиологического анализа. Определение серовара производят в реакции агглютинации в пробирках.

Экспресс-методы диагностики. Иммунохимические исследования. Для выявления антигенов менингококков в мазках из исследуемого материала используют метод встречного иммуноэлектрофореза. Антигены возбудителя также могут быть обнаружены в материале от больного в реакциях непрямой латекс-агглютинации, РНГА и др.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР.

Серодиагностика. Для ретроспективного подтверждения диагноза используют РНГА с парными сыворотками.

Схема 8. Микробиологическое исследование при менингококковой инфекции и бактерионосительстве Микробиологическая диагностика коклюша и паракоклюша Материал для исследования: мокрота, слизь из носоглотки. Материал берут стерильным ватным тампоном из носоглотки больного ребенка. Для взятия материала у маленьких детей тампон, приготовленный на тонкой эластичной проволоке, вводят через нос.



Бактериоскопическое исследование (схема 9). Бактериоскопический метод как таковой при диагностике коклюша не применяется. Для быстрого обнаружения и идентификации Bordetella pertussis используют иммунофлюоресцентный метод.

Бактериологическое исследование. Основной метод лабораторной диагностикикоклюша. Материал для посева берут с помощью носоглоточного тампона или методом "кашлевых пластинок". Для этого в момент появления кашля открытую чашку Петри с питательной средой подносят ко рту ребенкаи держат в течение 6-8 кашлевых толчков. Правильное ираннее взятие материала позволяет выделить возбудителя в начальном периоде болезни от 80-90 % больных. Материал засевают накаменноКУА иликровяные среды - картофельноглицериновый кровяной агар (среда Борде-Жангу) и молочно-кровяной агар. В питательные среды добавляют пенициллин для угнетения роста посторонней микрофлоры. Колонии B.pertussis на указанных средах обычно появляются через 48-72 ч культивирования. B.parapertussis - несколько раньше: через 24-72 ч.

Бордетеллы образуют мелкие (диаметром около 1 мм) выпуклые влажные блестящие колонии. На КУА колонии имеют серовато-кремовый цвет, а на среде Борде-Жангу приобретают жемчужный или ртутный блеск. Колонии B.parapertussis более крупные. На среде Борде-Жангу имолочно-кровяном агаре они образуют ограниченную зону гемолиза. Из колоний, выросших на чашках, готовят мазки, окрашивают их по методу Грама и микроскопируют. При наличии в мазках овоидных грамотрицательных палочек ставят ориентировочную реакцию агглютинации с коклюшной и паракоклюшной сыворотками. Затем подозрительные колонии пересевают в пробирки для дальнейшего изучения чистых культур.

Идентификацию выделенной культуры производят на основании комплексного изучения морфологических, культуральных, биохимических и серологических свойств (табл. 10). В отличие от других бордетелл B.pertussis не растет на простом питательном агаре и не изменяет цвета специальных питательных сред.

Для определения уреазы в агглютинационные пробиркивносят 0,3 мл 2 % растворамочевины, 0,3 мл густой суспензии испытуемой культуры и 2-3 капли 0,1 % спиртового растворафенолфталеина. В положительном случае через 20-мин появляется малиновое окрашивание, указывающее на расщепление мочевины уреазой.

Серологическую идентификацию бордетелл, дифференциацию видов и определение сероваров (серотипирование) проводят в реакции агглютинации с адсорбированными факторными сыворотками. При этом исходят из того, что антиген (фактор) 7 является родовым, а антиген (фактор) 1 присущ только B.pertussis, 14 - B.parapertussis и 12 - B.bronchisepticas.

Таблица 10. Дифференциальные признакиBordetella spp.

Признак B.pertussis B.parapertussis B.bronchisepticas Рост: на агаре (простом) - + (коричневая + окраска) на агаре с тирозином - + (ярко-коричневая + окраска) Изменение окраски:

КУА - Буро-коричневая - аровяного агара - Потемнение - Образование уреазы + + + Наличие антигенов:

родового 7 7 видового 1 14 Условные обозначения: (+) - наличие признака; (-) - отсутствие признака; цифрами обозначены номераантигенов.

При бактериологической диагностике коклюша может возникнуть необходимость дифференциации бордетелл от Наетоphilus influenzae, который часто встречается на слизистой оболочке дыхательных путей и вызывает пневмонии и другие воспалительные заболевания дыхательных путей. В отличие от бордетелл Н.influenzae растет только на кровяных питательных средах - кровяном агаре, "шоколадном" агаре Левинталя, содержащих гемин и коэнзим дегидрогеназы. Бактериологическое исследование продолжается не менее 5 дней.

Экспресс-методы диагностики Иммунохимические исследования. Метод ИФ: тампоном делают двамазка, высушивают их на воздухе ификсируют на пламени. Один мазок обрабатывают флюоресцирующими противококлюшными антителами, другой - паракоклюшными антителами. Препараты микроскопируют в люминесцентном микроскопе, просматривая не менее 50 полей зрения. О положительном результате свидетельствует обнаружение темных бактериальных клетокс четким светящимся венчиком.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования проводят методом ПЦР.

Серодиагностика. Реакции агглютинации и РСК применяют в основном для ретроспективного подтверждения диагноза и дифференциальной диагностики атипичных форм коклюша. Агглютинины в крови больных появляются на 3-4-й неделе заболевания в титрах 1:20 и выше. В условиях массовой вакцинации детей против коклюша диагностическое значение имеет нарастание титра антител в динамике болезни, поэтому реакцию ставят повторно через 4-5 дней.

Схема 9. Микробиологическое исследование при коклю ше и паракоклю ше Микробиологическая диагностика дифтерии Материал для исследования: мазки со слизистой оболочки зева и носа, пленкис поверхности миндалин и носоглотки Материал берут двумя ватными.

стерильными тампонами, один из которых используют для приготовления мазков, другой - для посева.

Бактериоскопическое исследование (схема 10). Мазки окрашивают по методу Грама, метиленовым синим по Леффлеру, по Нейссеру. Для Corynebacterium diphtheriae характерно наличие полярно расположенных зерен волютина и расположение в виде буквы "V". Corynebacterium pseudodiphtheriae и дифтероиды не имеют зерен волютина илисодержат их не на концах, а по длине палочки. Кроме того, сами бактерии располагаются в виде частокола. Применение люминесцентной микроскопии позволяет повысить эффективность исследования.





При этом C.diphtheriae можно отличить от других коринебактерий по коричнево-красному свечению зерен волютина которое они приобретают после, окраскифлюорохромом корифосфином. Цитоплазма этих бактерий дает зеленое илижелтое свечение. Однако C.diphtheriae часто изменяют свою морфологию, в частности, при санации зева антибиотиками. В настоящее время бактериоскопическое исследование при дифтерии практическине используют в связи с его низкой надежностью (высокой частотой ложноположительных и ложноотрицательных результатов).

Бактериологическое исследование. Является ведущим методом диагностики дифтерии. Материал засевают на кровяной агар и элективные питательные среды, содержащие теллурит: средаКлауберга (питательный агар с теллуритом натрия, глицерином идефибринированной кровью) и др. На средах с теллуритом задерживается рост кокков и другой микрофлоры зева что, способствует размножению возбудителя дифтерии. На теллуритовой среде C.diphtheriae образует черные колонии за счет восстановления теллурита (биовар gravis формирует колонии серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цветок маргаритки, биовар mitis - круглые выпуклые колонии черного цвета). Типичные колонии, представленные грамположительными палочками булавовидной формы с характерным расположением, содержащими зернаволютина, пересевают на кровяной агар для получения чистой культуры.

Для подтверждения диагноза дифтерии в первую очередь необходимо установить токсигенность выделенной культуры. Наличие токсинаопределяют с помощью различных серологических реакций. Применяют также метод ПЦР, позволяющий обнаружить присутствие у выделенных бактерий tох-гена, контролирующего синтез дифтерийного токсина Общепринятым методом.

определения токсигенности являлась реакция преципитации в агаре с антитоксической противодифтерийной сывороткой. Методы ИФА и ПЦР, разработанные в последние годы, являются более чувствительными и позволяют получить результат в течение 3-5 ч.

Схема 10. Микробиологическое исследование при дифтерии Определение токсигенности в реакции преципитации: в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15-20 % лошадиной сыворотки 0,3 %, мальтозы и 0,03 % цистина, кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой, содержащей 5000 АЕ/мл. Чашку подсушивают при 37 °С в течение 30 мин и засевают исследуемые культуры в виде перпендикулярных к бумаге штрихов на расстоянии 0,6-0,8 см от края бумаги. В качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. При размножении токсигенной культуры в месте соединения токсина с антитоксическими антителами в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий - "усов".

Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по морфологическим особенностям, культуральным и биохимическим признакам: пробы на цистиназу, уреазу, ферментация углеводов идр. (табл. 11).

Таблица 11. СвойстваC.diphtheriae и сходных с ней коринебактерий Вид Ферментация C.diphtheriae биовар gravis + - - + + +- + - + биовар mitis + + - + - +- + - + C.xerosis +- - + + - - +- - - C.pseudo- +- - - - - - - + - diphtheriticum Условные обозначения: (+) – наличие признака у 85-100 % штаммов; (-) – отсутствие признака; (+ -) – наличие признакау 16-84 % штаммов.

В случае выделения нетоксигенной культуры ставят дополнительную реакцию агглютинации с противодифтерийной сывороткой с целью выявления видоспецифического антигена C.diphtheriae.

Для определения цистиназы (проба Пизу) в столбик питательного агара с цистином уколом засевают исследуемую культуру. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. C.diphtheriae вызывают почернение среды по ходу посева (в результате образования сульфида свинца), вокруг которого появляется зона коричневого цвета, а на глубине 1 см от поверхности агара в среде образуется коричневое "облачко".

Для определения уреазы (проба Закса) готовят спиртовой раствор мочевины и раствор индикатора - фенолового красного, которые перед употреблением смешивают в соотношении 1:9 и разливают по 1-2 мл в агглютинационные с а х а р о зы г л ю к о зы к р а х м а л а З ер н а в о л ю т и н а Г ем о л и з То к с и г ен н о с т ь Ц и с т и н а за У р еа за А г г л ю т и н а ци я п р о т и в о д и ф т ер и й н о й с ы в о р о т к и пробирки. Затем исследуемые бактерии петлей вносят и растирают по стенке пробирки. После 20-30-минутной инкубации при 37 °С наблюдают расщепление мочевины уреазой, в результате чего средаприобретает красный цвет.

Экспресс-методы диагностики.

Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения tox-гена C.diphtheriae с помощью ПЦР.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты Преципитирующие антименингококковые сыворотки. Применяют с диагностической целью для обнаружения менингококкового антигена в спинномозговой жидкости (методом встречного иммуноэлектрофореза).

Эритроцитарные антительные менингококковые диагностикумы.

Применяют для обнаружения антигенов N.meningitidis в спинномозговой жидкости в РНГА.

Коклюшная вакцина. Содержит взвесь В.реrtussis, убитых формалином.

Применяют для обязательной активной специфической профилактикикоклюша.

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.