WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |   ...   | 12 |

Допированные полимеры используются в настоящее время в качестве различных антистатических добавок, в частности, антистатический слой из полианилина защищает компьютерные диски, выпускаемые компанией Хитачи. Такие полимеры представляют интерес для антирадарных покрытий, в создании световодов, в мембранных технологиях для разделения полярных жидкостей и газов, для чувствительных газовых и сенсоров, в литографических процессах и фотографии. Процесс допирования и дедопирования полимеров может управляться внешним напряжением, что используется для создания легких аккумуляторных батарей. Перспективным направлением использования электропроводящих полимеров легко поддающихся обработке является миниатюризация в микроэлектронике с использованием в электронных твердотельных схемах компонентов нужной конфигурации с размерами молекулярного уровня. Вероятно использование электропроводящих полимеров в конденсаторах, элементах памяти компьютеров, фотопреобразователях. В последнее время появилось много публикаций, особенно в сети “Интернет” о других областях применения электропроводящих полимеров. Сообщается, что некоторые из них при воздействии электрического напряжения или при химических воздействиях изменяют цвет, что используется при создании электронных оптических переключателей и устройств памяти. Электропроводящие полимеры перспективны для создания межэлементарных соединений с размерами молекулярного подуровня (1 нм), для изготовления высоковольтных кабелей, допированных таким образом, что проводящей частью окажется центральная, а наружная будет изолятором, в различных устройствах электротехнического и электронного оборудования и электроприборостроения. Прогресс вычислительной техники связывают с сочетанием электронных и оптических методов обработки информации. Фотоэлектронные компьютеры работают в тысячи раз быстрее, с высокой плотностью записи информации. Голографическую внешнюю память, основанную на эффекте изменения физических свойств под действием света, обеспечивает, например, фотореактивный поли-1ХГ-винилкарбазол. Исследователи фирмы «Кодак» получили трехслойную полимерную пленку, которая удваивает частоту излучения идущего от полупроводникового лазера - переводит свет из близкого ИК диапазона в видимый голубой, что позволяет более плотно записывать информацию на компакт-диске. За счет изменения состава боковых групп полиацетилена получен полидиацетилен, легче растворимый, чем исходное соединение. Из него легче формировать пленки, которые являются жидкокристаллическими полупроводниками. С использованием токопроводящих полимеров разработаны транзисторы с затвором и электронными переключателями (электрическим током между входом и выходом управляет специальный электрод-затвор). Переход к чисто полимерным устройствам позволит использовать простые методы трафаретной печати на изолирующий слой из полиэтилентерефталатной пленки. В таком устройстве на полиэтилентерефталатную пленку наносят пасту, бислой закрепляют на гибкой ленте матрицы, сверху изолятора из того же электропроводящего полимера делают входной и выходной электроды (органический полупроводник, содержащий шесть тиофеновых блоков). На смену тяжелым свинцовым, кадмий-никелевым, железо-никелевым аккумуляторам в настоящее время пришли литиевые аккумуляторы. Использование электропроводящих полимеров для изготовления активных частей источников тока позволяет исключить применение для них цветных металлов и снизить массу аккумуляторов вдвое, обеспечить электрохимическую обратимость, реализовать большие значения удельной мощности и энергоемкости, а также безотходную технологию их изготовления.

Разработан ряд интересных токопроводящих полимеров. Так гель на основе поликротоновой кислоты в слабощелочных водных растворах способен изменять свой объем под действием электрического тока. Британская компания Геловейтен разработала материал, способный менять свои свойства от диэлектрика до проводника. В Англии разработаны полимерные светодиоды, на основе полимеров с чередующимися фениленовыми и винильными группами. При помещении такой пленки между электродами она испускает желто-зеленый свет, что перспективно для создания экранов телевизоров и дисплеев.

5. Реакции макромолекул.

Реакционная способность макромолекул отличается от реакционной способности небольших молекул [1, 54]. Причина – наличие у макромолекул цепной структуры. В химических реакциях макромолекул проявляется конфигурационный и конформационный эффекты, надмолекулярный эффект и эффект соседнего звена.

Химические превращения макромолекул можно разделить на следующие типы: 1) полимераналогичные и внутримолекулярные превращения, 2) превращения, связанные с соединением полимерных цепей путем образования ковалентных связей, 3) деструктивные превращения.

В литературе описано много реакций модификации белков и нуклеиновых кислот.

Так белки можно модифицировать по аминогруппам, сульфгидрильным и карбоксильным группам, ароматическим циклам. Химические превращения по аминогруппе альдегидом и галогенангидридом представим так:

Рассмотрим модификацию формиатдегидрогеназы (ФДГ) по аминогруппам для придания гидрофобных свойств ферменту. Гидрофобную модификацию ФДГ проводят по аминогруппам лизина (рис. 32) хлорангидридом пальмитиновой кислоты [55]. Из данных рентгеноструктурного анализа известно, что на одну субъединицу ФДГ приходится аминогрупп лизина и часть из них располагается в области межсубъединичного контакта.

Каталитически важный остаток лизина находится в районе формиатсвязывающего участка активного центра ФДГ, следовательно, присутствие формиат-иона в реакционной среде является эффективной защитой от инактивации фермента при модификации.



Рис. 32. Аминогруппа лизина в белке.

К 0,8 мл 6 мг/мл раствора фермента в 0,1 М фосфатном буфере (рН=8,5) добавляют мкл 3 М раствора формиата натрия (для защиты активного центра фермента).

Реакцию инициируют добавлением 10 – 120 мкл раствора пальмитоил хлорида в ацетонитриле (1:1), через 30 мин препарат пропускают через фильтр (размер пор 0,мкм). Модифицированную ФДГ отделяют от низкомолекулярных реагентов методом гель-фильтрации. Работы по очистке препаратов белка проводятся на хроматографической системе низкого давления, предварительно уравновешенной калийфосфатным буфером (20 мМ, рН 8,5) с 20 мМ ЭДТА. Содержание белка контролируют по поглощению при 280 нм. Для концентрирования полученного фермента используют Amicon.

Отметим, что изменение гидрофильно-липофильного баланса ферментов путем химической модификации приводит к изменению активности и стабильности этих ферментов как в водной, так и в органической среде [55]. Однако пока не удается однозначно выяснить, как именно изменится стабильность фермента при той или иной модификации. Так модификация белков гидрофобными реагентами может приводить как к повышению, так и понижению термостабильности белков. Например, при модификации ангидридами уксусной, пропионовой, валериановой кислоты и малеиновым ангидридом аминогрупп пероксидазы во всех случаях наблюдалось увеличение термостабильности модифицированных препаратов по сравнению с нативным ферментом. Модификация субтилизина также приводит к увеличению термостабильности по сравнению с нативным белком. Однако показано, что термостабильность альфа-химотрипсина и трипсина, модифицированных стеароилхлоридом меньше, чем соответствующих нативных ферментов. Модификация альфа-химотрипсина гидрофильными альдегидами приводит к 100-1000-кратным эффектам стабилизации по отношению к необратимой термоинактивации при высоких температурах (выше 70 С). Было проведено сравнительное изучение термостабильности нативной ФДГ и модифицированной гидрофильно и гидрофобно. Процесс термоинактивации всех исследованных нами препаратов ФДГ следует кинетике первого порядка. Отметим, что в координатах реакции первого порядка эта зависимость не имеет точек перегиба, что свидетельствует о том, что реакция термоинактивации ФДГ псевдопервого порядка. Гидрофобная модификация приводит к повышению термостабильности фермента примерно в 2 раза. В случае же гидрофильной модификации термостабильность фермента уменьшается примерно в 5 раз.

Потеря термостабильности может быть связана как с ослаблением межсубъединичных контактов при гидрофильной модификации и приводящим к диссоциации димерной молекулы белка на мономеры, так и с облегчением разворачивания полипептидной цепи.

Для того чтобы прояснить механизм влияния модификации на стабильность фермента, мы изучили зависимость интенсивности собственной флуоресценции нативного и модифицированных препаратов ФДГ от концентрации мочевины в растворе, т.е. в условиях обратимой денатурации. Снижение интенсивности собственной флуоресценции белка связано с процессами разворачивания и диссоциации, а положение точки перегиба может служить мерой прочности межсубъединичных взаимодействий. Для модифицированных как гидрофильно, так и гидрофобно препаратов ФДГ точка полуинактивации смещается в сторону меньших концентраций мочевины. То есть гидрофильная и гидрофобная модификации ФДГ приводят к понижению стабильности в условиях обратимой денатурации в мочевине. Гидрофильная модификация ФДГ глюкозой может стабилизировать мономерную форму фермента и препятствует агрегации субъединиц в мягких условиях в системе обращенных мицелл. Гидрофобная модификация пальмитоилхлоридом ФДГ также приводит к стабилизации мономерной формы. Причем с увеличением степени модификации фермента ослабляются межсубъединичные взаимодействия и при больших степенях модификации образование димера модифицированной ФДГ в системе обращенных мицелл не происходит. Иными словами, независимо от природы модифицирующего агента (гидрофильный или гидрофобный), модификация приводит к падению стабильности в условиях обратимой денатурации в мочевине за счет ослабления межсубъединичных взаимодействий. Однако в случае необратимой термоинактивации гидрофильная модификация приводит к понижению стабильности, а гидрофобная, наоборот, к повышению стабильности. Дело здесь заключается в том, что, несмотря на то, что гидрофобная модификация приводит к ослаблению межсубъединичного контакта, наличие остатков жирной кислоты на поверхности белковой молекулы затрудняет выход полипептидных цепей в водный раствор, т. е. препятствует разворачиванию белковой глобулы.

Гидрофобная модификация глюкозооксидазы (ГО) N-гидроксисукцинимидом пальмитиновой кислоты. К 6 мл раствора ГО 4 мг /мл в 0,16 М калий фосфатном буфере (рН= 8,8) с дезоксихолатом натрия (2 мас.%) добавляют каждые 2 ч по 0,1 мл N гидроксисукцинимид пальмитиновой кислоты в 1,4-диоксане (4 порции). Молярное отношение ГО к модифицирующему агенту составляет 1:56. Реакцию проводят при перемешивании в течение 8 ч, а затем фильтруют через фильтр с размером пор 0,мкм. Модифицированную ГО отделяют от низкомолекулярных реагентов методом диализа. Диализ проводят 4 раза по 12 ч против 0,02 М ацетат-фосфатного буфера (рН= 5,5) при 4°. Полученный препарат лиофилизовывают.





Гидрофильная модификация ФДГ D(+)-целлобиозой. К 1 мл 2,5 мкМ раствора ФДГ в калий-фосфатном буфере (рН= 8,5) добавляют 30 мкл 0,25 М раствора D(+)-целлобиозы.

Реакцию проводят при постоянном перемешивании при 250С. Через 24 ч для восстановления основания Шиффа добавляют небольшими порциями 10 мкл раствора боргидрида натрия (5 мг/мл). При использовании в качестве восстанавливающего агента цианборгидрида натрия происходит полная потеря ферментативной активности. Это, по-видимому, связано с тем, что ион CN– является ингибитором ФДГ. После завершения реакции модифицированную ФДГ отделяют от низкомолекулярных реагентов методом гель-фильтрации. Работы по очистке препаратов белка проводят на хроматографической системе низкого давления на колонке (8.400 мм) с Sephadex G-(fine), уравновешенной калий-фосфатным буфером (20 мМ; рН=8.5) с ЭДТА (20 мМ).

Содержание белка контролируют по поглощению при 280 нм. Контроль чистоты фермента осуществляют по стандартной методике электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях, рекомендованной фирмой “Bio-Rad”(США). Наличие одной узкой полосы на электрофореграмме, соответствующей молекулярной массе 45 кДа (молекулярная масса одной субъединицы нативной ФДГ составляет 44 кДа), свидетельствует о гомогенности полученного препарата и отсутствии межмолекулярных сшивок.

Ранее отмечалось что, некоторые макромолекулы способны восстанавливаться на катоде и окисляться на аноде. Классический пример - цитохром С, который обратимо восстанавливается на катоде, благодаря перезарядке иона железа (Fe(+3)/Fe(2+)) [56].

Математическая модель процесса – аналитическое выражение (что существенно упрощает компьютерное моделирование):

A и B – предэкспотенциальные множители, m – масса частицы, l – ширина барьера, – разность между высотой барьера и полной энергией частицы, kБ – постоянная Больцмана, а – энергия активации, Т – абсолютная температура. Отметим, что может и не равняться а.

Вероятность туннельного эффекта за одно столкновение частицы с барьером определяется формулой:

Для частиц с массой 10-27 г при высотах барьера порядка 1 эВ, длинах барьера около 1 прозрачность потенциального барьера порядка 1.

Отношение (X) туннельного и надбарьерного вкладов в процесс переноса электрона определяется формулой:

Выход скорости реакции на плато при низких температурах свидетельствует в пользу туннельного механизма межмолекулярного переноса электрона по белку (рис. 33).

Рис. 33. Зависимость логарифма константы скорости от обратной температуры.

Понятно, что при конечной температуре вклад в скорость реакции дают как туннельная (второй член в уравнении), так и активационная составляющие (первый член в уравнении). Характерные энергии отрыва электрона от окисляющегося фрагмента в цитохроме С составляют порядка 6–7 эВ. Энергия избыточного электрона в белковой среде составляет порядка 1 эВ. Тем самым потенциальный барьер для туннелирования электрона никак не может быть меньше 5–6 эВ. Вероятность набрать такую энергию за счет тепловых флуктуаций при комнатных температурах крайне мала. Следует вывод, что перенос электрона с донора на акцептор в белковой среде даже при комнатных температурах носит туннельный характер. Более сложные модели рассматривают туннелирование и электронно-конформационные взаимодействия. Возможная роль конформационного движения: благоприятное перекрывание орбиталей для участников переноса электрона (стерический фактор) и изменение баланса сил (термодинамический фактор).

Имеется большой экспериментальный материал, указывающий на важную роль конформационной динамики белковой глобулы в организации процессов электронного переноса [56]. Под конформационной динамикой (подвижностью) понимаются относительные смещения белковых групп с амплитудами, заметно превышающими амплитуды валентных колебаний атомов. Изменение характеристик валентных колебаний с характерными временами порядка 0.1 пс и амплитудами до 0.01 нм происходит непосредственно в акте изменения электронного состояния групп, что обсуждалось выше в связи с электронно-колебательным взаимодействием. В белках же имеется еще один уровень организации атомных движений - конформационные движения с амплитудами порядка 0.1 нм. Эти движения характеризуются временами (релаксации) от сотен до миллионов пикосекунд. Времена релаксации конформационных движений в отличие от случая валентных колебаний резко увеличиваются при понижении температуры. Так как белковая глобула имеет очень маленький свободный объем и средние расстояния между атомами не превышают 0.01 нм, то конформационные движения происходят мелкими шажками.

Роль конформационных движений также пока неизвестна во всех деталях. С одной стороны, спонтанные тепловые движения белковых групп по конформационным степеням свободы способствуют выходу системы в реакционноспособную конфигурацию. Так, например, для реакций туннельного переноса электрона важно устроить хорошее перекрывание электронных орбиталей между участниками процесса. Для порфиринов форма участвующих в реакции электронных орбиталей напоминает цветок со многими лепестками. Понятно, что эффективное перекрывание в этом случае происходит при настройке за счет конформационных движений и определенной взаимной ориентации порфириновых циклов. С другой стороны, после акта переноса электрона появляются новые заряженные центры, и изменяется баланс электростатических сил в молекуле белка.

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |   ...   | 12 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.