WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |

Это приводит и к изменению равновесных положений молекулярных групп, то есть к определенному изменению пространственной структуры белка или конформационному переходу. В новой конформации микроокружение отдельных групп в принципе может существенно измениться и как следствие - изменится и их реакционная способность. Это происходит, например, с первичным и вторичным акцепторами в белке РЦ фотосинтезирующих бактерий. Тем самым создаются предпосылки для регуляции и управления в цепи последовательных реакций.

Макромолекулы могут иметь несколько реакционных центров [57]. Azotobacter vinelandii Ферредоксин I имеет два редокс-центра ([3Fe-4S]+ и [4Fe-4S]2+) (рис. 34).

Рис. 34. Структура Azotobacter vinelandii Ферредоксина I с выделенными ионами железа железо-серных кластеров.

Белок восстанавливается в три стадии, как показано на рис. 35.

Рис. 35. Схема восстановления макромолекулы Azotobacter vinelandii Ферредоксина I.

На пирографитовую поверхность электрода, полированную оксидом алюминия наносится -раствор, содержащий 1 10 М Azotobacter vinelandii Ферредоксина I, 2 10-4 М HEPES (N-2- гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислоты) и 0.1 М NaCl и выдерживается минуту. Затем электрод промывается и помещается в термостатируемую (4 0С) трехэлектродную ячейку для записи циклической вольтамперограммы. Раствор в ячейке – 0.1 М NaCl, 200 мкг/мл полимиксина В1, по 5 10-3 М уксусной кислоты, HEPES, MES (2-[N-морфолино]-этансульфокислоты), TAPS (N- трис-[гидроксиметил]-3-аминопропансульфокислоты) и необходимое количество раствора щелочи до установления значения рН=8.6. Потенциал циклируют в интервале от -0.3 В до -1.35 В относительно н.к.э. На катодной ветви наблюдаются пики восстановления исходной формы, а на анодной – пики окисления восстановленной формы.

Для моделирования катодной ветви вольтамперограммы используются следующие уравнения:

i = -nFAdГred/dt (30), E = E0 + (RT/nF)ln((Г – Гred)/Гred) (31);

I - ток, соответствующий потенциалу E, F - постоянная Фарадея, A – площадь электрода, R – универсальная газовая постоянная, T - абсолютная температура, n - число переносимых электронов, Г - общая поверхностная концентрация, Гred - поверхностная концентрация восстановленной формы, t - время.

Данный белок имеет два редокс-центра и восстанавливается в три стадии, как показано на рис.35. В щелочных средах процессы протонирования восстановленных форм сведены к минимуму. Пики белков шире и ниже рассчитанных по ранее приведенным формулам. Для учета отклонений системы от идеального поведения вводится коэффициент :

E = E0 + (RT/nF)ln((Г – Гred)/Гred) (32).

Электрохимические сигналы восстановления ферредоксина показаны на рис. (катодный ток имеет отрицательные значения). Катодная ветвь (1) соответствует = 1, а (2) подходит для случая < 1.

Рис. 36. Катодная ветвь восстановления макромолекул.

Интересным является вопрос о переносе электронов в цепи, содержащей макромолекулы. На рис. 37 показаны цепи электронного переноса. Соотношение между стандартными окислительно-восстановительными потенциалами следующее:

E0AE0D

Рис. 37. Энергетические диаграммы для цепей электронного переноса, содержащих четыре компонента (слева) и пять компонентов.

В цепи, содержащей четыре компонента вероятность нахождения электрона велика на компоненте С, а в цепи, содержащей пять компонентов – на компоненте E. Возможен и необратимый перенос электрона, если различия между энергиями компонентов (минимумы) значительны, и велики энергетические барьеры (максимумы), а также в случае диссипации (рассеяния) энергии при наличии сопряженных процессов. Таким образом, перенос электрона, в некоторых случаях реализуется и против градиента стандартного потенциала.

Механизм переноса электрона между глобулами довольно сложен. Белок-белковый перенос электрона в митохондриальных и микросомальных цепях электронного транспорта отличается от хорошо изученных в химии редокс-реакций металлокомплексов в растворе. Во-первых, в случае белков донор и акцептор, как правило, погружены в белковую матрицу и разделены на большие расстояния, так что непосредственный контакт между ними невозможен (дистанционный перенос электрона). Кроме того, анизотропные редокс-центры типа гем-групп достаточно легко фиксированы в белке и поэтому, в отличие от раствора, скорость переноса заряда должна зависеть от взаимной ориентации донора и акцептора. Наконец, полипептидная цепь белка, которая, с одной стороны, является макролигандом иона металла, а с другой - образует специфическую гетерогенную среду с уникальными релаксационными характеристикам. Эта среда сильно влияет как на окислительно-восстановительные свойства иона металла, а значит на скорость переноса электрона.

Очевидно, что существенный прогресс в изучении механизма столь сложного явления может быть достигнут только в случае, если структурные и физико-химические свойства участников реакции очень хорошо исследованы.

Изучено влияние рН, ионной силы и температуры на скорость переноса электрона в окислительно-восстановительной реакции между миоглобином (окси-Mb) и феррицитохромом с (Cyt с) для интактных и химически модифицированных белков [58].

Идентифицированы участки молекул Mb и Cyt с, участвующие в образовании комплекса, и определена его структура. Показано, что гемовые группы обоих белков в комплексе ориентированы копланарно и отстоят друг от друга на 2.9 нм. Найдено, что электростатические взаимодействия играют решающую роль в обеспечении эффективного переноса заряда [59]. С помощью метода нелинейной регрессии проанализирована применимость известных модельных уравнений (Бренстеда-Дебая-Хюккеля, ВеландаГрея, комплементарных взаимодействий и "параллельных дисков") к описанию зависимостей скорости электронного переноса от ионной силы в системе Mb-Cyt с.



Показано, что ни одна из этих широко распространенных моделей не позволяет связать получаемые оптимальные значения электростатических параметров (заряды, радиусы реагирующих частиц) с реальными значениями, характерными для белков в целом или их контактных участков [60].

Цитохромы - небольшие белки, способные к селективному переносу электрона между оксидоредуктазами [61]. Цитохром с - водорастворимый белок, содержащий железопорфирин (рис. 38). Его центральный атом железа способен к обратимому одноэлектронному восстановлению. Цитохром с может принимать электрон с одного мембранно-связанного белкового комплекса дыхательной цепи (Комплекс III, цитохром с оксидаза) и переносить его к следующему (Комплекс IV, цитохром с оксидаза). Каскад переноса электрона реализован и в процессе фотосинтеза (рис. 39).

Рис. 38. Железопорфирин.

Рис. 39. Модель сопряжения электронного транспорта с трансмембранным переносом протонов и синтезом АТФ.

Перенос электрона между цитохромом с и ферментами происходит в особых белковых комплексах [62]. Обратимое электрохимическое восстановление цитохрома с наблюдалось на Au-, Pt- и Ag-электродах, модифицированных монослоями различных промоторов. Обычно эти промоторы связаны с электродом посредством тиольных или дисульфидных групп и включают органическую функциональную группу, которая взаимодействует с остовом цитохрома с. Монослой промотора препятствует прямому контакту между белком и электродом, а значит и необратимой инактивации белка. Кроме того, взаимодействия между промотором и белком могут привести к особому расположению белка на поверхности, необходимому для достижения нужной короткой дистанции для переноса электрона. Самый распространенный промотор для активации поверхностных электрохимических процессов с участием цитохрома с - бис(4пиридил)дисульфид [63]. Могут использоваться также другие дисульфиды и тиолы [64].

Монослои аминокислот и олигопептидов рассматриваются как своеобразные промоторы, обеспечивающие протекание электрохимических реакций с участием цитохрома с и других цитохромов [65]. С той же целью использовали осажденные на золотом или серебряном электродах имидазол [66], тиофен [67] и иод [68]. При использовании электрода, модифицированного промотором, растворимый цитохром с способен эффективно и обратимо переносить электрон, катализируя как катодные, так и анодные реакции с участием целой группы ферментов. Примером катодного процесса может служить электровосстановление кислорода в воде, катализируемое переносом электрона на растворенную лакказу [69]. Процесс может включать и более длинную цепь переноса электрона (рис. 40).

Рис. 40. Биоэлектрокаталитическое восстановление кислорода под действием цитохром оксидазы с использованием Cyt c и Cyt c551 в качестве медиаторов многостадийного переноса электрона.

Перовой стадией конструирования организованного биоэлектрокаталитического слоя, состоящего из белков-медиаторов и ферментов, является осаждение монослоя белка, выполняющего функции матрицы и одновременно осуществляющего электронный перенос между электродом и последующими слоями белков. С этой целью положительно заряженные молекулы цитохрома с сорбировали в монослое с помощью электростатических взаимодействий на отрицательно заряженной поверхности электрода.

Заряд поверхности придавал слой тиокарбоновой кислоты [70, 71]. Специфическое расположение несимметрично заряженного цитохрома с в процессе его сорбции достигается путем использования поддерживающего потенциала на электроде [72]. После иммобилизации молекулы цитохрома с сохраняют способность к боковым (латеральным) и вращательным движениям по поверхности электрода, что способствует их взаимодействию со вторичными ферментами. Ковалентное связывание цитохрома с в самоорганизующихся слоях обычно приводит к случайной ориентации, поскольку в реакции иммобилизации участвуют сразу множество функциональных групп, окружающих ядро белка [73]. Жесткая фиксация молекул цитохрома с в этом случае препятствует достижению ими необходимой ориентации при взаимодействии с ферментами. Например, цитохром с, сорбированный в самоорганизующемся слое на поверхности электрода способен переносить электрон между NAD(P)H-цитохром-Р450редуктазой и электродом [70]. Эти результаты позволили предположить, что электростатически сорбированный цитохром с обладает определенной подвижностью, что позволяет ему менять ориентацию на поверхности электрода в соответствии с условиями переноса электрона. И наоборот, ковалентно связанный цитохром с имеет постоянную, случайно установившуюся в процессе иммобилизации ориентацию, которая не может обеспечивать его участие в реакции в качестве медиатора электронного переноса. Таким образом, положение белка на поверхности играет важнейшую роль в обеспечении взаимодействия между белками и ферментами и между ферментом и электродом.

Белки, синтезированные de novo и содержащие в составе геминовые участки, воспроизводят биохимические функции цитохрома b. Они также могут быть участниками реакций на твердых носителях [74]. Возможность контроля их структуры и редокссвойств делает такие белки перспективными медиаторами электронного переноса между ферментами и электродом. Так, был синтезирован de novo полипептид, состоящий из четырех спиральных участков, способный замещать цитохром b в медиаторных ферментативных реакциях на электроде. Этот белок (14.728 D), содержащий гистидиновые остатки в двух из четырех спиральных участках, был включен в поверхностный слой на золотом электроде. В его состав были введены две молекулы Fe(III)-протопорфирина IX. Полученная система оказалась способной к направленному каскадному переносу электрона [75]. Такая белковая система, синтезированная de novo, образует аффинный комплекс с цитохром-зависимой нитратредуктазой (NR) и миоглобином, реконструированным с помощью Co(II)-протопорфирина IX [76].





Образующийся поверхностный комплекс Fe(III)- протеин de novo - NR или Fe(III)- протеин de novo - Co(II)-миоглобин сшиваются глутаровым альдегидом и далее используются для электрокаталитического восстановления NO3– до NO2– (рис. 41).

Рис. 41. Строение нитрат-чувствительного электрода, полученного путем кросссшивки аффинного комплекса между NR и Fe(III)-протопорфирином, образованным с участием четырехспирального белка, синтезированного de novo.

Электрическая коммуникация изо-2-цитохрома c (изо-2-Cyt c, из Saccharomyces cerevisiae) достигается путем его ковалентного присоединения к остатку цистеина на монослое малеинимида на поверхности электрода. Константа ассоциации между монослоем изо-2-Cyt c и цитохромоксидазой (Сох) очень высока (Ka=1.2x107 M–1), что облегчает их взаимодействие на поверхности электрода. Электрод с монослоем изо-2-Cyt c сначала реагирует с цитохромоксидазой с образованием аффинного комплекса, плотно упакованного на поверхности электрода (около 2x10–12 моль см–2). Далее его обрабатывают глутаровым альдегидом.

Некаталитическое электрохимическое восстановление кислорода на чистом золотом электроде протекает с перенапряжением. Еще большее перенапряжение наблюдается на электроде, покрытом только Cyt c вследствие частичного блокирования поверхности.

Иными словами, если электрод покрыт только Cyt c, электрокаталитического восстановления кислорода не происходит. На электроде, покрытом изо-2-Cyt c - COx в присутствии кислорода восстановление кислорода протекает при потенциалах отрицательнее –0.07 В относительно н.к.э. Это говорит о том, что поверхностный слой работает в качестве своеобразного биокатализатора этой реакции, что достигается благодаря прямому электронному переносу между электродом и цитохромоксидазой через промежуточное участие изо-2-Cyt c. Подобные системы, осуществляющие согласованное четырехэлектронное восстановление кислорода важны в связи с созданием топливных биоэлементов [77].

Микропероксидаза-11 (рис. 42) в виде монослоя на поверхности золотого электрода [78, 79] обеспечивает аффинные взаимодействия с гемопротеинами и цитохромзависимыми ферментами [80].

Рис. 42. Микропероксидаза-11(МР-11).

Монослой MP-11 формирует такой комплекс с нативной нитратредуктазой (цитохром b5-зависимый фермент, NR из Escherichia coli). При этом достигается поверхностная концентрация NR 3.8x10–12 моль см–2 [79]. Константа ассоциации комплекса MP-11/NR определялась с помощью кварцевого электрорезонатора (QCM) и оказалась равной Ka=3.7x103 М–1. Кросс-сшивка аффинного комплекса глутаровым альдегидом дает стабильный ферментный электрод с прямым электронным переносом от белка, который осуществляет биоэлектрокаталитическое восстановление нитрата до нитрита (рис. 43). Биоэлектрокаталитическая реакция протекает с выходом по току до 85%, используемый для этого ферментный электрод может также служить ферментным амперометрическим сенсором на нитрат.

Рис. 43. Конструкция интегрированного нитратного электрода, полученного путем кросс-сшивки аффинного комплекса микропероксидазы-11 и NR глутаровым альдегидом на поверхности золотого электрода.

Полисахариды так же вступают в различные реакции, так как обладают большим числом функциональных групп.

Наиболее полно изучены химические превращения целлюлозы, обладающей ценными техническими свойствами и являющейся широко распространенным природным органическим полимером. Путем химических превращений целлюлозы получают ацетаты целлюлозы для производства волокна, лаков, пленок, пластмасс; нитраты целлюлозы для производства пластмасс, пленок, лаков и бездымного пороха; многочисленные простые эфиры целлюлозы, имеющие весьма разнообразное применение для производства лаков, пленок, электроизоляционных материалов, в качестве отделочных средств в текстильной промышленности.

Например, целлюлозу можно легко ацетилировать уксусным ангидридом.

В стакан или фарфоровую чашку помещают 0.2 - 0.4 г гигроскопической ваты, заливают её водой и выдерживают в ней 3-5 мин. Затем вату вынимают из воды, отжимают в фильтровальной бумаге, расщипывают и погружают небольшими порциями при размешивании стеклянной палочкой в коническую колбу, в которой находится смесь (5 мл уксусного ангидрида, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 1 капля концентрированной серной кислоты). При внесении в колбу влажной ваты происходит разогревание реакционной смеси, поэтому колбу охлаждают холодной водой.

Когда саморазогревание прекратится, колбу помещают в нагретую водяную баню (800С) и тщательно перемешивают реакционную смесь стеклянной палочкой до полного растворения целлюлозы. Полученный раствор выливают тонкой струей при перемешивании в стакан с 250 мл холодной воды. Выпадает осадок ацетата целлюлозы. Осадок отсасывают на воронке Бюхнера, промывают водой, расщипывают и сушат в фарфоровой чашке при нагревании. Сухой ацетат целлюлозы представляет собой аморфную массу, которая легко растирается в порошок. В условиях опыта получается преимущественно триацетат целлюлозы.

Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.