WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     || 2 |
THE GENE THERAPY ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ – МЕДИЦИНА IN THE XXI CENTURY XXI ВЕКА MEDICINE V. S. BARANOV..

‡-·„ „‰‡‚ ‚ The paper presents a definition of gene therapy, its origin and the main Решающие достижения молекулярной биологии results obtained. Basic и генетики в изучении тонкой структуры генов эукаtypes of gene therapy риот, их картировании на хромосомах млекопитающих, и прежде всего человека, впечатляющие успехи applications are briefly проекта “Геном человека” в идентификации и клоoutlined. Special attention нировании генов, мутации которых приводят к мноis paid to some social and гочисленным наследственным болезням, и, наконец, бурный рост в области биотехнологии и генной ethical problems related инженерии явились необходимыми предпосылками to human genome studies для того, чтобы от опытов на животных и теоретичеand gene therapy trials.

ских построений уже в 1989 году предпринять первые попытки лечения моногенных болезней.

Что же такое генная терапия Подразумевает ли ‡ ‰ „она лечение с помощью гена как лекарственного ‡, ‡препарата или только лечение путем коррекции мутантного гена Эти и многие другие вопросы неми ‚ „нуемо возникают при рассмотрении такого мног ‚‡обещающего, а возможно, и потенциально опасного ‚, ‰ „для человечества направления медицины грядущего XXI века, как генная терапия.

‡ ‡, ‚‡ ‡ ‚, Генную терапию на современном этапе можно ·‚‡ ‡‰определить как лечение наследственных, мульти ‰‡‚ „- факториальных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний путем введения генов в клетки „ ‡‡‡ ‚ пациентов с целью направленного изменения ге킇; „ ных дефектов или придания клеткам новых функ‡·‚‡fl, ‡ ‡ ций. Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты 22 мая 1989 года с ‚ „ целью генетического маркирования опухоль-ин‡ „ фильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирую ‡·- щей меланомы. Первым моногенным наследственным заболеванием, в отношении которого были ‚‡. · ‚‡ применены методы генной терапии, оказался на·‡ ‡ „следственный иммуннодефицит, обусловленный му - тацией в гене аденозиндезаминазы (ADA). 14 сентября 1990 года в Бетесде (США) четырехлетней ‡ ‡ девочке, страдающей этим достаточно редким забоfl ‰‚ „леванием (1 : 100 000), были пересажены ее собст ‡. венные лимфоциты, предварительно трансформированные вне организма (ex vivo) геном ADA (ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедура была повторена с интервалом 3–5 месяцев [1]. За три года терапии в общей сложности проведены 23 внутривенные трансфузии ADAтрансформированных Т-лимфоцитов без видимых.. – XXI © ‡‡‚.., неблагоприятных эффектов. В результате лечения состояние пациентки настолько улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не боРешающим условием успешной генотерапии явяться случайных инфекций. Столь же успешным ляется обеспечение эффективной доставки, то есть оказалось и лечение второй пациентки с этим заботрансфекции (в широком смысле) или трансдукции леванием. В настоящее время клинические испыта(при использовании вирусных векторов) чужеродния генной терапии этого заболевания проводятся в ного гена в клетки-мишени, обеспечение длительИталии, Франции, Великобритании и Японии.

ного функционирования его в этих клетках и создаВ 1997 году число допущенных к клиническим ние условий для полноценной работы гена (его испытаниям протоколов уже составляло 175, более экспрессии). Трансфекция может проводиться с ис2000 пациентов приняли участие в их реализации пользованием чистой (“голой” – naked) ДНК, леги[2]. Большинство таких проектов (около 80%) касарованной (встроенной) в соответствующую плазмиются лечения онкологических заболеваний, а также ВИЧ-инфекции (СПИДа). Вместе с тем и в совре- ду, или комплексированной ДНК (плазмидная ДНК, менных исследованиях по генной терапии необхо- соединенная с солями, белками (трансферрин), органическими полимерами (DEAE-декстран, полидимо учитывать, что последствия манипулирования генами или рекомбинантными ДНК in vivo изучены лизин, липосомами или частицами золота), или недостаточно. ДНК в составе вирусных частиц, предварительно В странах с наиболее продвинутым уровнем ис- лишенных способности к репликации.

следований в этой области, особенно в США, медиОсновные методы доставки чужеродных генов в цинские протоколы с использованием смысловых клетки разделяются на химические, физические и последовательностей ДНК подвергаются обязабиологические. Эффективность трансфекции и интельной экспертизе в соответствующих комитетах и теграционная способность трансдуцированной чукомиссиях. В США таковыми являются Консультажеродной ДНК при различных способах трансфективный комитет по рекомбинантным ДНК (Recomции в ДНК-клетки мишени приведены в табл. 1.

binant DNA Advisory Committee, RAC) и Управление Только вирусные векторы или генетические констпо лекарствам и пищевым продуктам (Food and рукции, включающие вирусные последовательносDrug Administration, FDA) с последующим обязати, способны к активной трансдукции, а в некототельным утверждением проекта директором Нацирых случаях и к длительной экспрессии чужеродных ональных институтов здоровья (National Institutes of генов. Из более 175 уже одобренных протоколов Health) [1]. В Европе такие протоколы составляют и утверждают в соответствии с рекомендациями Ев- клинических испытаний по генотерапии более ропейской рабочей группы по переносу генов и ген- предполагают использовать вирусную трансдукцию ной терапии (European Working Group on Human и около 100 из них основаны на применении ретроGene Transfer and Therapy) [3]. вирусных векторов [2].



Таблица 1. Основные характеристики генетической трансфекции in vitro [1] Метод Трансдукция Интеграция Экспрессия Химические Са-фосфат преципитация Низкая Низкая Транзиторная Физические Электропорация Низкая Низкая Транзиторная Микроинъекция Высокая Низкая Транзиторная “Бомбардировка” частицами золота Высокая Низкая Транзиторная Слияние Липосомы Низкая Низкая Транзиторная Рецептор-опосредованный эндоцитоз ДНК-белковый комплекс Высокая Низкая Транзиторная ДНК-комплекс-вирусная капсида Высокая Низкая Транзиторная Рекомбинантные вирусы Аденовирус Высокая Низкая Транзиторная Аденоассоциированный вирус (AAV) Высокая Низкая Длительная Вирус герпеса (HSV) Низкая Низкая Слабая Вирус иммунодефицита (HIV) Высокая Высокая Длительная Вирус мышиной лейкемии Молони (MoMLV) Высокая Высокая Длительная Вирус ветряной оспы (Vaccinia) Высокая Низкая Слабая, ‹3, Обзор данных позволяет прийти к заключению, венные регуляторные элементы, которые необходичто, несмотря на усилия многих лабораторий мира, мы для правильной работы гена, в нужной ткани и в все уже известные и испытанные in vivo и in vitro век- должное время.

торные системы далеки от совершенства [4, 5]. Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro прак тически решена, а ее доставка в клетки-мишени В зависимости от способа введения экзогенных разных тканей in vivo успешно решается (главным ДНК в геном пациента генная терапия может провообразом путем создания конструкций, несущих редиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непоцепторные белки, в том числе и антигены, специсредственно в организме (in vivo). Клеточная генная фичные для тех или иных тканей), то другие характерапия или терапия ex vivo предполагает выделение теристики существующих векторных систем – и культивирование специфических типов клеток стабильность интеграции, регулируемая экспреспациента, введение в них чужеродных генов, отбор сия, безопасность – все еще нуждаются в серьезных трансфецированных клеток и реинфузию их тому доработках.

же пациенту (рис. 2). В настоящее время в большинПрежде всего это касается стабильности интегстве допущенных к клиническим испытаниям прорации. До настоящего времени интеграция в геном грамм генной терапии используется именно этот достигалась только при использовании ретровирусподход [5].

ных либо аденоассоциированных векторов (см.

Генная терапия in vivo основана на прямом вветабл. 1). Повысить эффективность стабильной индении клонированных и определенным образом теграции можно путем совершенствования генных упакованных последовательностей ДНК в специконструкций типа рецептор-опосредованных сисфические ткани больного. Особенно перспективтем (рис. 1) либо путем создания достаточно станым для лечения генных болезней in vivo представбильных эписомных векторов (то есть ДНК-струкляется введение генов с помощью аэрозольных или тур, способных к длительной персистенции внутри инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия ядер). В последнее время особое внимание уделяетразрабатывается, как правило, для лечения пулься созданию векторов на базе искусственных хромомонологических заболеваний (муковисцидоз, рак сом млекопитающих (Mammalian Artificial Chromoлегких).

somes). Благодаря наличию основных структурных Разработке программы генной терапии предшеэлементов обычных хромосом такие мини-хромосоствуют тщательный анализ тканеспецифической мы длительно удерживаются в клетках и способны экспрессии соответствующего гена, идентификация нести полноразмерные (геномные) гены и их естестпервичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимичеИзвлечение мутантных ский анализ патологического процесса. Все эти или опухолевых клеток Ген данные учитываются при составлении соответствующего медицинского протокола. Апробацию процедуры генокоррекции наследственного заболевания проводят на первичных культурах клеток Культивирование и генетическая трансформация Асиалогликопротеин ДНК Отбор трансформированных Гепатоцит клеточных клонов Трансплантация Асиалогликопротеигенетически новый рецептор транформированных клеток Аденовирус Рис. 2. Рецептор-опосредованный перенос гена.

Рис. 1. Генотерапия способом ex vivo. Клетки по- ДНК-последовательность нужного гена соединялучают от пациента, культивируют in vitro, прово- ют с определенным мембранным рецептором дят их генетическую трансформацию, отбирают (например, асиалогликопротеином в случае кленужные клоны клеток и возвращают в организм ток печени), а также с аденовирусом, обеспечивапациента. В случае опухолей клетки трансформи- ющим проникновение генной конструкции в ядро руют генами, резко усиливающими иммунный от- клетки. Такой комбинированный вектор обеспевет организма, облучают и трансплантируют под- чивает эффективную адресную доставку гена в кожно тому же пациенту клетки печени.. – XXI больного, в которых в норме функционально акти- нетической конструкции, содержащей смысловую вен данный ген. На этих клеточных моделях оцени- (кодирующую белок) и регуляторную части гена. На вают эффективность выбранной системы переноса следующем этапе решается проблема вектора, обесэкзогенной ДНК, определяют экспрессию вводи- печивающего эффективную, а по возможности и мой генетической конструкции, анализируют ее адресную доставку гена в клетки-мишени. Затем взаимодействие с геномом клетки, отрабатывают проводится трансфекция (перенос полученной способы коррекции на биохимическом уровне. конструкции) в клетки-мишени, оценивается эффективность трансфекции, степень коррегируемосИспользуя культуры клеток, можно разработать ти первичного биохимического дефекта в условиях систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, клеточных культур (in vitro) и, что особенно важно, однако проверка надежности работы этой системы in vivo на животных – биологических моделях. Тольможет быть осуществлена только на уровне целого ко после этого можно приступать к программе клиорганизма. Поэтому такое внимание в программах нических испытаний.





по генной терапии уделяется экспериментам in vivo на естественных или искусственно полученных мо делях соответствующих наследственных болезней у животных [6]. Успешная коррекция генетических дефектов у таких животных и отсутствие нежелаУспех первых клинических испытаний явился тельных побочных эффектов генной терапии являмощным стимулом для ускорения развития новых ются важнейшей предпосылкой для разрешения генотерапевтических методов применительно к клинических испытаний.

другим наследственным болезням. В табл. 2 привеТаким образом, стандартная схема генокоррек- дены список болезней, для которых принципиальции наследственного дефекта включает серию по- но возможен генотерапевтический подход, геноследовательных этапов. Она начинается созданием коррекция которых с большой вероятностью будет полноценно работающей (экспрессирующейся) ге- осуществлена уже в обозримом будущем, а также те Таблица 2. Наследственные заболевания, генокоррекция которых находится на стадии клинических испытаний (КИ), экспериментальных разработок (ЭР) и принципиально возможна (ПВ) [1, 7] Болезнь Дефектный ген Клетки-мишени Стадия Иммунодефицит Аденозиндезаминаза Лимфоциты КИ Иммунодефицит Пуриннуклеозидфосфорилаза Лимфоциты ПВ Семейная гиперхолистеринемия Рецептор липопротеинов низкой Гепатоциты КИ плотности Гемофилия В Фактор IX Фибробласты КИ Гемофилия А Фактор VIII Миобласты, фибробласты ЭР Болезнь Гоше (сфинголипидоз) -Глюкоцереброзидаза Макрофаги, стволовые клетки КИ Болезнь Хантера Идуронатсульфатаза Макрофаги, стволовые клетки ПВ Синдром Гурлера L-идуронидаза Макрофаги, стволовые клетки ПВ Эмфизема легких -1-Антитрипсин Лимфоциты ЭР Муковисцидоз CF-трансмембранный регулятор Эпителий бронхов КИ Фенилкетонурия Фенилаланингидроксилаза Гепатоциты ЭР Гипераммонемия Орнитинтранскарбамилаза Гепатоциты ПВ Цитрулинемия Аргиносукцинатсинтетаза Гепатоциты ПВ Мышечная дистрофия Дюшенна Дистрофин Миобласты, миофибриллы ЭР Талассемия -Глобин Эритробласты ЭР Серповидноклеточная анемия -Глобин Эритробласты ЭР Респираторный дистресс-синдром Сурфактант белок В Эпителий бронхов ЭР Хронический грануломатоз NADPH-оксидаза Гранулоциты ЭР Болезнь Альцгеймера Белок – предшественник -амилои- Нервные клетки ЭР да (ААР) Болезнь Паркинсона Тирозингидроксилаза Миобласты, фибробласты, нервные ЭР клетки Метахроматическая лекодистрофия Арилсульфатаза А Стволовые клетки крови, нервные ПВ клетки Синдром Леш-Нихана Гипоксантинфосфорибозилтранс- Нервные клетки ПВ фераза, ‹3, заболевания, для которых уже имеются официально Уже сейчас на современном уровне знаний о геутвержденные протоколы и которые находятся на номе человека теоретически вполне возможны таразных стадиях клинических испытаний.

кие его модификации с целью улучшения некоторых физических (например, рост), психических и интеллектуальных параметров. Таким образом, со временная наука о человеке на своем новом витке развития вернулась к идее улучшения человеческой Одновременно с развитием исследований в обпороды, когда-то постулированной выдающимся ласти генокоррекции наследственных дефектов английским генетиком Ф. Гальтоном и развитой его успешными также оказались поиски методов тераучениками и последователями в Великобритании певтического использования смысловых последо(К. Пирсон, Л. Пенроуз, Дж. Холдэйн), в России вательностей ДНК для лечения ненаследственных (Н.К. Кольцов, Ф.П. Филипченко), в США (Г. Мёлзаболеваний, и главным образом злокачественных лер). Дальнейший ход истории, как известно, полопухолей и вирусных инфекций. Существенно, что ностью дискредитировал саму идею улучшения чеименно в этих разделах патологии поиски путей геловеческой породы. Однако грядущее всевластие нокоррекции проводятся особенно интенсивно, а человека над собственным геномом заставляет число уже одобренных протоколов клинических исвновь и вновь возвращаться к этой теме, делает ее пытаний во много раз превышает число таковых для предметом постоянных оживленных дискуссий в лечения моногенных болезней [7].

широкой и научной печати [2]. Не вызывает сомнеВ табл. 3 перечислены основные методологичесния, что первоначальные опасения, связанные с кие подходы к генотерапии различных опухолей, генной инженерией человека, были неоправданны.

разработанные и уже широко используемые. МноУже признано целесообразным применение генной гие из этих подходов вполне приложимы и для борьтерапии для лечения многих заболеваний. Единстбы с наиболее серьезными инфекционными заболевенным и непременным ограничением, сохраняюваниями, например с ВИЧ-инфекцией (СПИДом).

щим свою силу и в современных условиях, является то, что все генотерапевтические мероприятия должРезультаты первых клинических испытаний этих подходов оказались в высшей степени обнаде- ны быть направлены только на конкретного больживающими, в особенности при лечении нейроде- ного и касаться исключительно его соматических генеративных и онкологических заболеваний нерв- клеток.

ной системы.

Pages:     || 2 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.