WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 ||

Превращение хоризмовой кислоты (хоризмата) в префеновую (префенат) представляет собой внутримолекулярную перегруппировку, включающую поворот энол-пирувильной группы с образованием переходного состояния, предполагаемая структура которого показана на рисунке. Стабилизация такого состояния, обеспечиваемая его прочным связыванием с ферментом, создает возможность разрыва связи углерода, находящегося в пятом положении цикла, с кислородом и последующее образование связи между первым углеродным атомом цикла и углеродом энол-пирувильной группы. Внизу показана структура стабильного аналога переходного состояния.

..

TyrArgАБ NH O Asp-HHN H HO O O + H2N NH2 O H ArgNH2 - O O NH O Asn-H+ O NH2 O O + OH2N NH H2N H2N Arg-HO- O GluHO O- HO HO Tyr-LHNH SH O CysO Asn-HРис. 5. Схематическое изображение комплекса, образуемого абзимом (А) и хоризматмутазой из B. subtilis (Б) с аналогом переходного состояния.

Пунктирными линиями обозначены водородные связи, возникающие между разными группами молекулы аналога переходного состояния и аминокислотными остатками белка, участвующими в ее связывании. В случае абзима ( А) это остатки, формирующие антиген-связывающий центр (так как абзим – это антитело, выработанное на гаптен – аналог переходного состояния). В случае хоризматмутазы (Б) это остатки, входящие в активный центр фермента.

химического катализа. Характерный пример – ан- нению с естественными ферментами. Как видно из титела, гидролизующие сложные эфиры карбоновых рис. 7, в действии сериновой протеиназы (наприкислот, – первые абзимы, описанные в литературе.

мер, химотрипсина) важную роль играет общий Согласно теоретическим представлениям, меха- кислотно-основный катализ, обеспечивающий акнизм реакции переноса ацила на воду включает пе- тивацию гидроксильной группы серина, а также пореходное состояние тетраэдрической структуры с следующую активацию молекулы воды. Активный отрицательным зарядом на кислороде карбонильной центр абзима лишен такой способности, так как не группы (рис. 6). Стабилизация этого заряда – важсодержит групп, способных осуществлять общий нейшее условие осуществления реакции; предполакислотно-основный катализ. Поэтому, в отличие от гается, что активный центр фермента эстеразы фермента, функционирующего при физиологичесобеспечивает такую стабилизацию при связывании ких значениях рН, абзим проявляет свою активпереходного состояния.

ность при рН выше 9,5, где ионизирована ОН-группа тирозина, которая и атакует субстрат. Активный Структура переходного состояния может быть центр абзима оказывается также неспособным “имитирована” стабильным аналогом, имеющим обеспечить активацию молекулы воды, и вторая сходную тетраэдрическую конфигурацию и отрицательный заряд на кислороде (эфир фосфоната, рис. 6). Эфиры фосфоната известны как мощные H H ингибиторы эстеразных реакций, что говорит об их + H H O O R прочном связывании с ферментом и подтверждает C O HO R их сходство с предполагаемой структурой переход- O Rного состояния. Использование эфиров фосфоната O R OH Переходное состояние в качестве гаптенов оказалось успешным и привело O C к получению антител, обладающих эстеразной акO C Rтивностью. Детальное исследование свойств этих Rабзимов показало, что их эффективность в ряде слуO O R чаев приближается к эффективности соответствующих ферментов; более того, оказалось, что в ходе P катализа происходит ковалентное присоединение O Rацильной группы субстрата к белку, аналогично сиСтабильный аналог туации, имеющей место при нуклеофильном катализе сериновыми протеиназами.

Рис. 6. Реакция гидролиза сложного эфира кар Наряду с этим выявились и существенные отли- боновой кислоты и структура эфира фосфоната – чия, показавшие несовершенство абзимов по срав- стабильного аналога переходного состояния.

, ‹8, Э н з и м Ser His Ser His Ser His Ser His Ser His N N N N N O H O O O O H H H H R C O R1 R C OR1 R C HO R C OH R C OH O O- O O- O HOR+ + А б з и м Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr O- O O O OOH R C O R1 R C O R1 R C R C OH R C OH O O- O O- O OR+ + Рис. 7. Механизм реакции гидролиза сложного эфира карбоновой кислоты, катализируемой энзимом (химотрипсином) или абзимом.

Первая стадия катализа энзимом – отход протона от гидроксильной группы серина(Ser) на гистидин (His). Это обеспечивает возникновение отрицательного заряда на кислороде серина и возможность атаки карбонильного углеродного атома субстрата с образованием тетраэдрического интермедиата – переходного состояния. В его стабилизации важную роль играет положительный заряд в так называемой “анионной ямке”, формируемой активным центром. Следующая стадия, в которой гистидин выступает как общая кислота, – это отход протона от гистидина на кислород так называемой “уходящей группы”, то есть OR1, с освобождением продукта – спирта (НOR1).

Гистидин вновь приобретает способность выступать в качестве общего основания, оттягивая протон на этот раз от молекулы воды. Образовавшийся ион гидроксила осуществляет нуклеофильную атаку на карбонильный углерод с образованием нового переходного состояния, также стабилизируемого взаимодействием с положительно заряженным участком активного центра. Следующий затем переход протона с гистидина на кислород серина сопровождается освобождением второго продукта реакции. Абзим катализирует ту же реакцию без участия общего кислотно-основного катализа, используя остаток тирозина (Tyr) в качестве нуклеофила, образующего ковалентный тетраэдрический интермедиат, также стабилизируемый взаимодействием с положительно заряженным участком активного центра. Первый продукт реакции освобождается в непротонированной форме (- OR1).



стадия реакции идет за счет нуклеофильной атаки сам факт успешного получения антител, обладаюсвободным ионом гидроксила. щих каталитической активностью. Блестящее подтверждение гипотезы Полинга–Дженкса можно Приведенное сравнение показывает, что, хотя считать лучшим доказательством справедливости абзимы могут не уступать естественным ферментам представлений о комплементарности активного в эффективности химического катализа, они безусцентра фермента структуре переходного состояния ловно являются менее совершенными с точки зререакции. Рентгеноструктурные исследования, прония способности функционировать в физиологичеведенные на комплексах хоризматмутазы и соответских условиях. Понимание причин этих отличий ствующего абзима с аналогом переходного состоянеобходимо для направленного поиска путей усония, подтвердили, что оба катализатора обеспечивают вершенствования абзимов. Вместе с тем оно имеет прочное связывание той геометрической структуважное значение для развития теоретических предры, которая предполагается в качестве переходного ставлений в энзимологии.

состояния данной реакции. Аналогичные рентгеноструктурные исследования проведены в последнее время и с другими абзимами. Детальный сравни тельный анализ взаимодействий между белком и лигандом может дать ценную информацию о том Наиболее демонстративным вкладом в учение о вкладе, который вносят отдельные контакты в эфферментативном катализе, безусловно, является фективность катализа; он важен и для проверки..

...

.

.

.

.

.

.

правильности теоретических представлений о тью абзимов, отличающей их от других биологичесструктуре переходного состояния. ких катализаторов: они могут быть выработаны для катализа почти всех химических реакций. ПотенциИмеющиеся в настоящее время данные позвоальное число таких химических превращений неляют считать, что в большинстве случаев абзимы сравненно выше, чем число реакций, происходящих можно рассматривать по сравнению с естественныв живых системах и катализируемых соответствуюми ферментами как катализаторы примитивного щими ферментами. Используя абзимы, исследоватипа. Изучение их свойств – один из подходов к потель приобретает возможность создавать совершенниманию механизмов усовершенствования свойств но новые катализаторы для их применения как в ферментов в ходе эволюции, обеспечивших их эфнаучных, так и в практических целях.

фективное функционирование в живой клетке.

Трудно переоценить роль, которую может сыграть использование абзимов в органической химии.

Во-первых, это увеличение специфичности катали за (например, селективное расщепление пептидной связи между конкретными аминокислотными осРаботы по усовершенствованию каталитических татками). Во-вторых, это разделение энантиомеров свойств антител получили значительное развитие.

(молекул, содержащих три разных заместителя у угМы ограничимся лишь краткой характеристикой леродного атома, называемого асимметрическим;

используемых в настоящее время экспериментальони существуют в двух изомерных формах, являюных подходов. Прежде всего это подходы, направщихся зеркальным отражением друг друга). Абзиленные на введение в активный центр абзимов мы, как и ферменты, обладают стереоспецифичнофункциональных групп, присутствующих в активстью и могут связывать один энантиомер в 1000 раз ных центрах соответствующих ферментов и способпрочнее, чем другой. Поскольку получение чистых ных обеспечивать разные типы химического каталиправо- и левовращающих популяций молекул, неза. Примером может служить прием, получивший отличимых по их химическим свойствам, – задача название “bait and switch” (приманить и включить) весьма трудная, если вообще разрешимая, примеи основанный на иммунизации мыши гаптеном – нение соответствующих абзимов может оказаться аналогом переходного состояния, несущим дополчрезвычайно полезным в подобных случаях, напринительный заряд. В том случае, если этот заряд помер при синтезе фармакологических препаратов. В ложительный, можно ожидать, что антитела, выранастоящее время, к сожалению, многие лекарства ботанные на такой гаптен (наиболее прочно его готовятся как смеси энантиомеров, лишь один из связывающие), будут содержать в участке связывакоторых активен в медицинском отношении, а друния группы, заряженные отрицательно. При удачгой нередко вызывает побочные реакции. В-третьном расположении таких групп (например, карбоких, это катализ трудно идущих химических преврасильных) в активном центре абзима они могут щений. В том случае, если определенный субстрат принимать участие в катализе, увеличивая его эф(А) способен претерпевать превращения по разным фективность. Помимо описанного выше иммунопутям с образованием разных продуктов:

логического подхода, для введения функциональных групп (а также молекул кофакторов, ионов С А В, металлов) в область активного центра абзимов мов отсутствие катализатора предпочтительной окагут быть использованы методы химической модижется реакция с наименьшей энергией активации, фикации, а также большой набор молекулярно-бинапример А В. Однако использование абзима, ологических приемов.

прочно связывающего переходное состояние реакПоявившаяся в последние годы возможность ции А С и смещающего равновесие в сторону оперировать со структурой генов, кодирующих антиобразования данного переходного состояния, притела, позволяет включать в активные центры абзиводит к изменению баланса энергии в пользу пути мов не только новые аминокислоты, но и отдельные превращения А С, который в отсутствие катафрагменты полипептидной цепи. Нет сомнений, что лизатора является менее кинетически выгодным.





сочетание разных подходов может обеспечить, соОсобую роль может сыграть применение катаобразно с замыслом исследователя, значительные литических антител в биотехнологии и медицине, и изменения каталитических свойств абзимов, приэто опять обусловлено их уникальной способносближая их к свойствам естественных ферментов.

тью катализировать любые химические реакции в дополнение к тем, для которых существуют естест венные ферменты. Можно ли ввести каталитичесОчень важной, если не основной, причиной кое антитело в клетку и заставить его там функциобурного развития исследований, посвященных ка- нировать Ответ на этот вопрос был получен в талитическим антителам, является исключительная работе, проведенной на штамме дрожжей, лишенперспективность их практического использования. ных вследствие мутации в структурном гене, кодируОна прежде всего связана с уникальной особеннос- ющем хоризматмутазу, способности синтезировать, ‹8, ароматические аминокислоты. Используя генно- инженерные подходы, авторы включили ген абзиК настоящему времени описано более 60 реакма, обладавшего хоризматмутазной активностью, в ций, катализируемых абзимами. По каталитичесгенетический аппарат дрожжевой клетки. Ген аккой эффективности некоторые абзимы не уступают тивно экспрессировался, и проявившаяся активестественным ферментам, а по специфичности даность абзима вполне компенсировала недостаток же превосходят их. Абзимы могут быть выработаны фермента. Таким образом была показана принцидля катализа любой химической реакции и пригопиальная возможность направить эукариотическую товлены в сколь угодно больших количествах. Разклетку по пути синтеза катализаторов, созданных работка научной базы усовершенствования каталируками человека и потенциально способных осущетических антител для их использования интенсивно ствлять любые химические реакции.

ведется в ряде мощных научных центров, объединяВесьма заманчивы перспективы использования ющих химиков и иммунологов. Уже не подлежит каталитических антител в терапевтических целях.

сомнению, что эти катализаторы могут найти шиИммунная система организма могла бы быть “улучрокое применение в биологии, химии, промышленшена” за счет выработки антител, которые способности и медицине. Есть все основания ожидать, что ны не только связывать токсины, бактерии, вирусы абзимы будут одним из важных инструментов биоили раковые клетки, но и катализировать их разрутехнологии, которая скорее всего станет преобладашение. При этом было бы достаточно даже невысоющей технологией XXI века.

кой каталитической активности; введение безвредного коньюгата гаптена могло бы обеспечить длительный эффект. Другой подход может быть основан на введении в организм человека готового аб- 1. Schultz P.G. The interplay between chemistry and biology in the design of enzymatic catalysts // Science. 1988. V.

зима. Применение такого подхода зависит от разра240. P. 426 – 443.

ботки техники получения моноклональных антител, 2. Green B.S., Tawfik D.S. Catalytic monoclonal antibodпригодных для использования в медицине. В силу ies: tailor-made, enzyme-like catalysts for chemical reacмалой доступности моноклональных антител челоtions // Biotechnol. 1989. V. 7. P. 304 – 310.

века основное внимание сосредоточено на исполь3. Chook Y.M., Gray J.V., Ke H., Lipscomb W.N. The зовании антител, полученных при иммунизации monofunctional chorismate mutase from Bacillus subtilis.

мышей.

Structure determination of chorismate mutase and its comЧтобы уменьшить степень иммунологической plexes with a transition state analog and prephenate, and implications for the mechanism of the enzymatic reaction несовместимости, применяют методы генной инже// J. Mol. Biol. 1994. V. 240. P. 476 – 500.

нерии, позволяющие конструировать “химерные” 4. Lerner R.A., Tramontano A. Antibodies as enzymes // или “гуманизированные” антитела, сочетающие Biochem. Sci. 1987. V. 12. P. 427 – 430.

элементы структуры мышиных и человеческих ан5. Janda K.D. New strategies for the design of catalytic anтител. В первом случае молекула антитела человека tibodies // Biotechnol. Prog. 1990. 6. P. 178 – 181.

сохраняет все элементы тяжелых и легких цепей, за 6. Danishefsky S. Catalytic antibodies and disfavored reacисключением их вариабельных N-концевых отрезtions // Science. 1993. V. 259. P. 469 – 470.

ков (VL и VH, см. рис. 1), на место которых вводят 7. Tang Y., Hicks J.B., Hilvert D. In vivo catalysis of a metсоответствующие отрезки моноклонального антиabolically essential reaction by an antibody // Proc. Natl.

тела мыши. Таким образом, антитело человека стаAcad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 8784 – 8786.

новится носителем антиген-связывающего центра антитела мыши. Более совершенным вариантом яв* * * ляется “гуманизированное” антитело, в котором антителу мыши принадлежат лишь гипервариаНаталья Константиновна Наградова, доктор биобельные элементы, формирующие антиген-связылогических наук, профессор, главный научный совающий центр. Такие антитела уже успешно приметрудник Института физико-химической биологии няются для лечения вирусных заболеваний, и есть им. А.Н. Белозерского МГУ, лауреат Государственоснования ожидать, что абзимы займут достойное ной премии. Область научных интересов – энзимоместо среди терапевтических средств данного типа. логия. Автор трех монографий и более 150 статей.

..

Pages:     | 1 ||










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.