WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     || 2 |
CATALYTIC ANTIBODIES КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА N. K. NAGRADOVA..

‚ „‰‡‚ ‚ Theoretical grounds of... ‚‡ the preparation of catalytically active antibodies (abzymes) are consid- ered. Similarities and difОбласть физико-химической биологии, связанная с исследованием каталитических антител, то ferences between enzyme есть антител, способных функционировать как биоand antibody molecules in логические катализаторы, возникла недавно – меtheir interaction with speнее десяти лет назад. И вместе с тем она развивается чрезвычайно бурно, так как представляет собой одcific ligands are preно из наиболее перспективных направлений, сочеsented. Principles of prepтающее в себе элементы иммунологии, энзимолоaration of the abzymes гии, молекулярной биологии, органической химии и генетической инженерии. Оно связано с созданиcapable of catalyzing difем и изучением катализаторов нового типа, испольferent types of reactions зование которых открывает принципиально новые are delineated. The perвозможности для работ фундаментального и прикладного характера. Интересно, что теоретические spectives for the use of основы этого научного направления были заложеabzymes in biotechnology ны почти полвека назад на основании чисто умоand medicine are disзрительных соображений, возникающих при сравнении свойств ферментов и антител. Лайнус cussed.

Полинг в 1948 году постулировал, что важным различием между этими группами белков является то, ‡ - что фермент не так строго комплементарен своему специфическому субстрату, как антитело гомоло ‚ fl гичному антигену. Наиболее прочное связывание ‡, ·‡‰‡ ‡реализуется между активным центром фермента и ‡ ‡‚- переходным состоянием реакции. Последующее развитие энзимологии подтвердило справедливость (‡·‚). ‡‡этих положений и позволило расшифровать струꂇ ‰турные основы функционирования многих фер‚‡ ‡fl ‰ ментов; не менее значительный прогресс был достигнут и в понимании молекулярных механизмов ‡ ‡ действия антител. С учетом этой информации рас‡‡ ‚ ‚‡смотрим, что объединяет антитела и ферменты, с ‰‚ - одной стороны, и каковы принципиальные различия между ними, с другой.

„‡‰‡. fl ‡·‚, · ‡‡‚‡ ‡ ‡ ‚. ·‰‡Общим свойством ферментов и антител являетfl ‚ ся то, что это – белки, обладающие характерной ‚‡fl ‡·‚ ‚ пространственной структурой и способностью связывать специфические молекулы (лиганды) – суб·„ ‰страт или антиген. Большая часть ферментов пост.

роена из сочетания -cпиралей, -складок и гибких петель, образующих уникальную трехмерную структуру, строго постоянную для данного белка. Напомним, что -спиральная структура полипептидной цепи стабилизируется внутрицепочечными..

© ‡„‡‰‚‡.., водородными связями между витками спирали, в Эмилем Фишером, не учитывает конформационкаждой из которых содержится 3 аминокислотных ных изменений, сопровождающих катализ и играюостатка. Участки полипептидной цепи, не способ- щих важнейшую роль в его реализации.

ные “скручиваться” в -спираль, могут приобреВ отличие от ферментов антитела (главным обтать вытянутую зигзагообразную конформацию, разом иммуноглобулины G) построены по единому получившую название -структуры. Параллельные плану (рис. 1). Молекула антитела состоит из двух отрезки цепи, находящиеся в -конформации, тяжелых (55 кДа) и двух легких (25 кДа) полипептидсвязываются между собой межцепочечными водоных цепей, связанных дисульфидными мостиками.

родными связями, образуя -складки. Даже незнаПространственная структура иммуноглобулина G чительные изменения аминокислотной последовапредставлена -складками и петлями; -спиральтельности (иногда единичные мутации) могут ные участки отсутствуют. Громадное разнообразие привести к нарушению нативной (то есть функциоантител, вырабатываемых иммунной системой, нально активной) конформации молекулы и к изобъясняется тем, что N-концевые участки обеих цеменению (или потере) ее каталитических свойств.

пей (первые 108 аминокислот), так называемые ваАктивный центр фермента формируется из аминориабельные области (VH и VL), кодируются множекислотных остатков, часто удаленных в первичной ством разных генов. В процессе дифференцировки структуре, но сближенных в пространстве при своклетки, продуцирующей антитело, один из множерачивании белка в нативную конформацию. Оконства генов, кодирующих вариабельную область, сочательное формирование активного центра происединяется с геном, кодирующим “константную” ходит в процессе его взаимодействия с участниками часть молекулы (постоянной структуры). Благодаря реакции (субстратом, кофактором); можно сказать, бесчисленному количеству возможных комбиначто активный центр фермента не предсуществует, а ций возникает громадное разнообразие антител, образуется в результате специфических конформапродуцируемых разными клетками. Антиген-связыционных изменений, индуцируемых субстратом.

вающий центр формируется при сочетании элеменТаким образом, взаимодействие фермента со своим тов структуры, принадлежащих вариабельным участсубстратом не может быть уподоблено “замку и клюкам обеих цепей (VL и VH). При этом основной вклад чу”, так как эта модель, предложенная в 1890 году в специфичность взаимодействия антиген–антитело вносят три участка L-цепи и три участка H-цепи, называемые гипервариабельными. В пространственной структуре молекулы они представлены в виVH VH де петель, обладающих большой гибкостью и подвижностью.

VL VL Принципиально важным является то обстоятельство, что специфическое узнавание антителом CH1 CHсвоего антигена есть не что иное, как выбор из гроCL CL FAB мадного разнообразия предсуществующих структур -S-Sтой из них, которая способна наиболее прочно свя-S-Sзать антиген. Этим и объясняется способность имCH2 CHмунной системы обеспечить связывание чужеродного соединения любой природы. В отличие от активного центра фермента активный центр антиCH3 CHтела предсуществует, а не формируется в результате взаимодействия со специфическим лигандом; он, таким образом, комплементарен, то есть оптимально структурно соответствует основному состоянию лиганда и может быть уподоблен “замку” с “клюРис. 1. Схематическое изображение структуры чом”-антигеном. В качестве антигена может выстуантитела.



Молекула антитела состоит из двух полипептид- пать как высокомолекулярное соединение, так и ных цепей (тяжелой и легкой), связанных между молекула малого размера (гаптен), если она присособой через остатки цистеина, образующие диединяется к носителю – макромолекуле.

сульфидные мостики. N-концевые области обеих цепей (VL – легкой цепи, VH – тяжелой цепи) сильно Специфическое взаимодействие антитела со различаются по аминокислотной последовательсвоим лигандом напоминает аналогичное взаимоности у антител, синтезируемых разными клеткадействие фермента со своим субстратом. Однако, ми иммунной системы. Остальные части молекулы (СL легкой цепи и CH, CH и CH тяжелой цепи) как уже указывалось, отличие функций этих белков 1 2 имеют аминокислотные последовательности, не (назначение антитела – как можно прочнее свяразличающиеся у антител, синтезируемых разнызать антиген, чтобы удалить его; назначение ферми клетками, и поэтому называются “константнымента – связать субстрат, чтобы обеспечить его ми”, или постоянными. FAB – фрагмент молекулы антитела, способный связывать антиген. дальнейшее превращение в продукт) обусловливает, ‹8, -S-S-S-SG то обстоятельство, что очень прочное связывание субстрата невыгодно для эффективного катализа.

Переходное состояние ( ) Действительно, главной движущей силой ферментативного катализа является увеличение энергии связывания по мере приближения к переходному G состоянию реакции – именно это усиление связы Gсвяз вания субстрата и является причиной снижения энергии активации химической реакции, обеспечиваемого ферментом.

G кат ES Связывание фермента с лигандом, складываюS EP щееся из слабых нековалентных взаимодействий (водородные связи, электростатические взаимоP действия, вандерваальсовы взаимодействия, гидрофобные связи), сопровождается уменьшением свободной энергии системы, что выражается отрицательной величиной ( Gсвяз = - RTlnKравн). Для то- G = G кат + Gсвяз го чтобы обеспечить превращение субстрата в про Gсвяз = - RTlnKравн дукт, требуется затратить энергию, необходимую для ориентации реагирующих групп, образования Рис. 2. Энергетический профиль односубстратнестабильных зарядов, перегруппировки связей и ной реакции.

др. Это иллюстрируется “холмом” на энергетичесS – субстрат, ES – фермент-субстратный комком профиле реакции (рис. 2). Участники реакции плекс, EP – комплекс фермент–продукт, P – продолжны преодолеть этот барьер и оказаться поднядукт. Энергия активации ( G ) складывается из двух составляющих: положительного члена Gкат, тыми на более высокий энергетический уровень, то отвечающего энергии активации химических стаесть оказаться в переходном состоянии. Энергия, дий, в ходе которых происходит образование и необходимая для достижения переходного состояразрыв связей, и отрицательного члена - Gсвяз, ния, называется энергией активации ( G ). Переотвечающего энергии связывания переходного ходное состояние – это геометрическая и элек- состояния.

тронная структура, отражающая комбинированное состояние фермента и субстрата, в котором реализуторый постулировал в 1969 году, что если бы удалось ется оптимальная ориентация реагирующих групп и выработать антитело, комплементарное структуре происходит постоянное образование и разрыв свяпереходного состояния реакции, то оно должно бызей. Концентрация переходного состояния и его ло бы катализировать эту реакцию, ускоряя достивремя жизни очень малы; переходное состояние жение переходного состояния. Так были заложены трудно зафиксировать и невозможно выделить.

теоретические основы получения каталитических антител. Однако потребовалось еще 17 лет, чтобы Скорость реакции зависит от величины энергии оказалась возможной экспериментальная проверка активации: чем выше G, тем ниже скорость. Это справедливости этих представлений.

понятно, так как скорость реакции пропорциональна концентрации активированного комплекса, которая тем выше, чем ниже энергия актива-, ции. Удивительная эффективность ферментов как катализаторов объясняется их способностью сни- жать энергию активации и смещать равновесие в К 1986 году возникли реальные условия для посторону образования переходного состояния. Долучения каталитических антител. Это, во-первых, стигается это путем очень прочного связывания накопление информации, необходимой для пониструктуры переходного состояния. Поскольку энермания молекулярного механизма химических реакгия связывания переходного состояния ( Gсвяз = ций и синтеза аналогов переходного состояния, то = - RTlnKравн) – величина отрицательная, ее возрасесть стабильных соединений, структура которых тание будет снижать энергию активации: G = близка к предполагаемой структуре переходного со= G + (- RTlnKравн), (см. рис. 2). Увеличение кат стояния. Во-вторых, это возможность получать анэнергии связывания лиганда по мере перехода от титела, гомогенные по структуре, то есть являющиесубстрата к переходному состоянию – это движуся продуктом одной клетки. В результате ее деления щая сила ферментативного катализа.





возникает клон клеток, обладающих всеми генетиИными словами, активный центр фермента ческими особенностями исходной клетки и синтекомплементарен не исходному субстрату (как пред- зирующих антитела одинаковой специфичности полагает концепция “ключ–замок”), а переход- (моноклональные антитела). Чтобы обеспечить поному состоянию. Эта идея, впервые выдвинутая стоянный рост клеток в культуре, используют спеЛ. Полингом, была затем развита У. Дженксом, ко- циальную технику, основанную на слиянии клеток,..

продуцирующих антитела, с клетками миеломы, такие катализаторы получили название абзимы.

способными к неконтролируемому делению. Это К настоящему времени получены десятки абзимов, приводит к образованию клеток гибридомы, устой- катализирующих реакции разных типов. Рассмотчиво продуцирующих большие количества гомо- рим некоторые примеры.

генных антител со специфичностью, определяемой исходной клеткой. Последнее обстоятельство очень, существенно, так как ответ иммунной системы ор ганизма на введение антигена заключается в синте зе громадного разнообразия антител, вырабатывае мых разными клетками и различающихся по структуре вариабельных областей.

На рис. 3 изображена схема реакции, катализиРаботы по получению каталитических антител руемой феррохелатазой – конечным ферментом в были одновременно начаты в нескольких лаборато- цепи реакций биосинтеза гема. Метилированный риях; сопутствовавший им успех обеспечил интен- порфирин (N-метилпротопорфирин), являющийся сификацию исследований и привел к возникнове- мощным ингибитором данной реакции, имитирует нию нового научного направления, связанного с структуру переходного состояния; он был испольсозданием биологических катализаторов с заранее зован в качестве гаптена для получения каталитичезаданными свойствами. По аналогии с энзимами ских антител. Абзимы, выработанные на данное А CH3 HC CH2 CH3 HC CHC C C C HC C C CH HC C C CH N N H3C C C C C CH3 H3C C C C C CHM2+ NH HN N M2+ N H2C C C C C CH CH2 H2C C C C C CH CHN N CH2 HC C C CH CH2 HC C C CH COO- C C COO- C C CH2 CH3 CH2 CHCH2 CHCOO- COOПротопорфирин IX Металлопорфирин Б CH3 HC CHC C HC C C CH N H3C C C C C CHNH MET N H2C C C C C CH CHN CH2 HC C C CH COO- C C CH2 CHCHCOON-Метил-протопорфирин IX Рис. 3. Реакция, катализируемая феррохелатазой (А). Включение иона железа (М2+) в состав протопорфирина IX c образованием протогема реализуется благодаря некоторому искажению структуры субстрата; предполагается, что переходное состояние реакции близко по своему строению к структуре N-метил-протопорфирина IX (Б).

, ‹8, соединение, оказались весьма эффективными ката- ноструктурного анализа обоих комплексов были лизаторами, лишь в 10 раз уступавшими естествен- выявлены типы взаимодействий, ответственных за ному ферменту в активности. Успех этой работы связывание аналога переходного состояния (рис. 5).

подтвердил правильность представлений о вероят- Как видно на рисунке, это водородные связи и эленой структуре переходного состояния реакции, ка- ктростатические взаимодействия. Фермент образутализируемой феррохелатазой. ет наибольшее число контактов с одной из карбоксильных групп молекулы аналога переходного Вторым примером реакции, механизм которой состояния (рис. 5Б ), тогда как второй карбоксил не содержит таких элементов химического катали(на рисунке внизу) расположен у входа в активный за, как общий кислотно-основный или нуклеоцентр и полностью доступен растворителю. В слуфильный катализ, может служить Клайзеновская чае антитела этот последний образует водородную перегруппировка, катализируемая хоризматмутасвязь с тирозином, а гидроксил в “верхней” части зой. На рис. 4 показана схема этой реакции (энзицикла, по-видимому, фиксируется недостаточно матический механизм катализа пока неизвестен) и прочно из-за отсутствия в его окружении второго предполагаемая структура переходного состояния.

остатка аргинина. В совокупности с другими отлиНа основании этой структуры был синтезирован чиями это приводит к недостаточно эффективной стабильный аналог переходного состояния. Это окстабилизации переходного состояния, и, как следсабициклическое соединение (см. рис. 4) оказалось ствие, к замедлению катализа.

сильным ингибитором хоризматмутазы, связывавшимся с ферментом в 100 раз прочнее, чем субстрат.

, Среди антител, выработанных на данное соедине ние, оказались абзимы, обеспечивавшие тысяче кратное ускорение хоризматмутазной реакции. Такое ускорение, однако, было на три порядка ниже, Хотя стабилизация переходного состояния – чем характерное для естественного фермента. Впол- важнейший фактор ферментативного катализа, в не понятный интерес к причинам, обусловливаю- действии большинства ферментов существенную щим это отличие, побудил исследователей провести роль играют также элементы химического катасравнительный анализ структуры комплексов, об- лиза (общий кислотно-основный и ковалентный разуемых ферментом или абзимом с аналогом пере- катализ). Оказалось, что в некоторых случаях абходного состояния реакции. На основании рентге- зимы также способны использовать элементы OOC OOC OOC COOO COOO O COOOH HO OH Переходное состояние H O - O C O C O O HO Аналог переходного состояния Рис. 4. Реакция, катализируемая хоризматмутазой.

Pages:     || 2 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.