WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 ||

но-функциональных исследований, но чаще всего для этого необходимы реконструированные препараты, так Самый простой способ – это удаление детергента с как многие мембранные белки могут проявить свою помощью диализа через полупроницаемую целлофафункциональную активность только тогда, когда они новую мембрану. Поскольку молекулы детергента донаходятся в полноценном мембранном окружении. статочно малы, чтобы пройти через поры диализной СОРОСОВСКИЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЖУРНАЛ, ТОМ 8, №1, БИОЛОГ ИЯ мембраны, а концентрация его мономеров в воде, зави- щих белок полосы 3, который отвечает за транспорт сящая от ККМ, сравнительно высока, то детергент по- анионов в мембране эритроцитов. Хорошо видно, что степенно переходит из солюбилизата в диализующий полученные препараты содержат частицы овальной раствор. При этом его содержание в смешанных ми- формы размером около 100 нм, ограниченные одной целлах уменьшается и, когда оно становится достаточ- мембраной. На фотографиях, полученных методом зано низким, мицеллы трансформируются в мембранные мораживания-скалывания при большом увеличении, структуры. Этот способ хорош для детергентов с высо- можно видеть, что в мембрану вкраплены еще более кой ККМ, таких, например, как октилглюкозид или мелкие частички, которые принимают за белки, внедхолат натрия. Но неионные детергенты с низкой ККМ ренные в липидный бислой. Как правило, реконструитипа тритона Х-100 при диализе удаляются не полно- рованные белоксодержащие мембраны представляют стью. Другой недостаток этого метода состоит в его собой замкнутые пузырьки (или везикулы), которые длительности, так как даже в лучшем случае удаление получили название протеолипосомы (более подробно детергента может занять несколько суток. о липосомах и везикулах см: Барсуков Л.И. // СОЖ.

1998. № 10. С. 2–9).

Более быстрый способ основан на удалении детерКонечно, весьма желательно, чтобы реконструирогента с помощью гель-фильтрации, когда солюбилизат ванные мембраны по своей морфологии, структурной пропускают через инертный гель, размер пор которого организации, физико-химическим характеристикам и достаточно велик, чтобы удержать молекулы детергенфункциональной активности были бы максимально та, но мал по сравнению с образующимися мембранблизки к своим природным прототипам. Следует, одными частицами, которые свободно проходят между нако, сказать, что приведенные на рис. 4 микрофотогранулами геля. Несмотря на быстроту, этот метод не графии являются на редкость удачными, и пришлось всегда удобен в работе, особенно когда требуется пронемало потрудиться, чтобы найти их в громадном вовести реконструкцию большого количества образцов.

рохе публикаций, посвященных реконструкции мембЕще быстрее, а фактически почти мгновенно реран. Чаще всего результаты реконструкции бывают не конструкцию можно осуществить методом быстрого столь хороши, потому что до сих пор реконструкция разбавления. Для этого солюбилизат разводят больявляется скорее искусством, чем наукой. Дело в том, шим объемом не содержащей детергента среды, в речто нет ни универсального метода реконструкции, ни зультате чего содержание детергента в мицеллах резко универсального детергента, которые были бы пригодны падает ниже предельного уровня, которым определяетна все случаи жизни. Поэтому исследователю, сталкися момент начала формирования мембраны. Этот мевающемуся с необходимостью получить реконструиротод универсален и годится для удаления практически ванные мембраны, зачастую приходится полагаться на любого детергента. Проблема лишь в том, что сам обрасобственную интуицию и опыт предшественников, зец при этом сильно разбавляется, да и детергент удаследуя некоему набору эмпирических правил.

ляется из мембраны далеко не полностью, что может С учетом сказанного выше не стоит удивляться тоотрицательно сказаться на качестве реконструированму, что, как правило, намного легче сформулировать ного мембранного препарата.

С максимальной полнотой детергент может быть аб удален из мембраны путем его адсорбции на гидрофобных полимерах. Этот способ особенно хорош для удаления остаточных количеств детергента из уже сформиро200 нм вавшихся мембранных частиц. Однако для удаления детергента из исходного солюбилизата он малоприго- в ден, так как на начальных стадиях реконструкции удаление детергента может сопровождаться адсорбцией значительных количеств белка и липида на полимере.

Поэтому обычно этот метод используют в комбинации с другими способами на конечной стадии удаления де200 нм 200 нм тергента.

Рис. 4. Морфология реконструированных мембЧТО МОЖНО СЧИТАТЬ ХОРОШЕЙ СБОРКОЙ ранных везикул, содержащих белок полосы 3, по данным электронной микроскопии: а – негативное Что же представляют собой реконструированные контрастирование, б и в – замораживание-скалымембраны На рис. 4 приведены электронные микрование (из: Scheuring et al. // J. Membrane Biol. 1986.

фотографии реконструированных мембран, содержа- Vol. 90. P. 123–136) БАРСУКОВ Л.И. КАК СОБРАТЬ МЕМБРАНУ (СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ И РЕКОНСТРУКЦИЯ МЕМБРАН) БИОЛОГ ИЯ критерии идеальной реконструкции, чем успешно ее состоянии, что позволило установить их химическое осуществить. Очевидно, что такая реконструкция долж- строение и выяснить молекулярные механизмы функна приводить к гомогенной популяции моноламел- ционирования.

лярных (то есть однослойных) протеолипосом одного Реконструированные системы дают прекрасную размера с одинаковым соотношением липид–белок.

возможность изучать принципы, лежащие в основе Желательно, чтобы реконструированная мембрана структурной организации биологических мембран, и имела такую же проницаемость, как и нативная, и чтовыяснять тонкие детали межмолекулярных взаимодейбы протеолипосомы имели достаточный внутренний ствий в мембранах с помощью различных физико-хиводный объем, позволяющий измерить содержание мических методов.

транспортируемых в него веществ. Мембрана протеоМетодами реконструкции удается воспроизводить липосом не должна содержать остаточного детергента, сложнейшие системы, ответственные за такие жизнена ее липидный состав должен быть оптимальным для но важные функции, как, например, энергетическое проявления функциональной активности данного белобеспечение клетки, транспорт метаболитов, рецепция ка. Этот перечень можно было бы продолжить и дальи передача информации, а также регуляция внутриклеше, если бы не еще одна принципиально важная проточных процессов.

блема, которой мы пока не касались в нашей статье.

И наконец, знание принципов самосборки молеРечь идет о топологической асимметрии мембран.

кул в мембранные структуры дает нам, с одной стороДело в том, что все нативные мембраны асимметричны ны, возможность понять, как формируются мембраны в том смысле, что их компоненты (как белки, так и ливнутри клетки, а с другой – позволяет применить эти пиды) неодинаковым образом распределены между напринципы для построения искусственных систем, персружной и внутренней сторонами мембраны. В идеале пективных с точки зрения возможностей их практичереконструированные мембранные белки должны иметь ского применения. Именно в этом направлении идет строго определенную ориентацию в мембране, соотсегодня дальнейшее развитие исследований в области ветствующую их ориентации в нативной мембране или реконструкции мембран.

отвечающую задачам поставленного эксперимента. В случае липидов также желательно иметь возможность ЛИТЕРАТУРА задавать им нужное трансмембранное распределение.

Однако на практике эти требования осуществить весьма 1. Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функсложно, так как топологическая ориентация мембранции: Пер. с англ. М.: Мир, 1997.

ных компонентов зависит (иногда непредсказуемым 2. Биологические мембраны: Методы: Пер. с англ. / Под ред.

образом) от многих параметров, а также от методов, ис- Дж.Б. Финдлея, У.Г. Эванза. М.: Мир, 1990. С. 196–250.

пользуемых для солюбилизации и реконструкции.

3. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение, 1987. С. 513–636.

Все это показывает, что проблема состоит не в том, чтобы провести реконструкцию вообще (как мы с вами 4. Кагава Я. Биомембраны: Пер. с яп. М.: Высш. шк., 1985.

теперь знаем, она происходит самопроизвольно), а в 5. Рэкер Э. Биоэнергетические механизмы: Новые взгляды:

Пер. с англ. М.: Мир, 1979.

том, чтобы сделать это правильно или, говоря другими словами, сделать реконструкцию направленной на по- 6. Rigaud J.-L., Pitard В., Levy D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: Application to energy-transducing memлучение мембран с заданной структурой и функциоbrane proteins // Biochim. et biophys. acta. 1995. Vol. 1231.

нальными свойствами. Пока эта задача окончательно P. 223–246.

еще не решена, но уже имеются методические подхо7. Lasic D.D. Liposomes: From Physics to Applications. Amsterды, позволяющие изменять в нужном направлении dam: Elsevier, 1993. P. 243–251.

свойства реконструированных мембран.

Рецензент статьи Ю.А. Чизмаджев ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящее время многие проблемы, связанные с * * * реконструкцией мембран, уже решены, свидетельстЛеонид Иванович Барсуков, кандидат химических вом чему является колоссальное количество статей, наук, доцент кафедры физико-химической биологии опубликованных на эту тему с начала 60-х годов XX в.

и биотехнологии Московского физико-технического Не будет преувеличением сказать, что впечатляющие института, ведущий научный сотрудник Института успехи, достигнутые сегодня в изучении мембранных биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овбелков, напрямую связаны с применением методов сочинникова РАН. Область научных интересов – биололюбилизации и реконструкции. С помощью этих мето- гические и искусственные мембраны. Автор более дов многие белки были выделены в индивидуальном 100 научных работ.

СОРОСОВСКИЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЖУРНАЛ, ТОМ 8, №1,

Pages:     | 1 ||










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.