WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     || 2 |
БИОЛОГ ИЯ БИОЛОГ ИЯ КАК СОБРАТЬ МЕМБРАНУ (СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ И РЕКОНСТРУКЦИЯ МЕМБРАН) Л. И. БАРСУКОВ Московский физико-технический институт, Долгопрудный Московской обл.

Пожалуй, сегодня не нужно убеждать кого-либо в том, что исследования биологических мембран предHOW TO ASSEMBLE A MEMBRANE ставляют собой одно из важнейших направлений со(MEMBRANE SOLUBILIZATION временной биологии. Играя ключевую роль в регуляAND RECONSTITUTION) ции потоков вещества, энергии и информации в клетке, мембраны вовлечены во все без исключения L. I. BARSUKOV стороны ее жизнедеятельности. По этой причине внимание многих ученых во всем мире уже давно привлеA remarkable complexity and heterogeneity of чено к проблемам мембран, и общее число публикаций на эту тему огромно. Статьи, посвященные биологичеbiological membranes require special ским мембранам или отдельным внутриклеточным approaches to their studies. Membrane solubiмембранным системам, широко представлены и в данlization and reconstitution enable essential ном журнале (см., например: СОЖ. 1996. № 3, 4, 6;

simplification of a system under study by isola1997. № 1, 3, 5–10; 1998. № 1, 3–6).

tion of the most important constituents and Исследования мембран в значительной мере базиsubsequent reconstitution in artificial memруются на двух основных методических приемах: это branes with controlled composition, properties разборка нативной (то есть природной) мембраны на and structural organization. Methodology of составляющие ее элементы и последующая полная или частичная сборка искусственной мембраны с испольthe membrane self-assembly on reconstitution зованием всех или части компонентов исходной мембis discussed.

раны. Применительно к мембранам эти приемы получили название “солюбилизация” и “реконструкция”, и Исключительная сложность и гетерогенименно о них пойдет далее речь.

ность биологических мембран требуют Следует сказать, что разборка изучаемых объектов специальных подходов для их изучения. Мена составные элементы и их последующая сборка с цетоды солюбилизации и реконструкции мемлью воспроизведения либо всего объекта целиком, либран позволяют существенно упростить бо отдельных его фрагментов, наиболее важных для поддержания структуры и проявления характерных изучаемые системы путем выделения из функций, являются излюбленным методом молекуних наиболее важных компонентов и их пелярной биологии клетки. Достаточно вспомнить усревода в искусственные мембраны с конпешные эксперименты по реконструкции вирусов, ритролируемым составом, свойствами и босом и бактериальных флагелл из входящих в их структурной организацией. Рассмотрены состав субъединиц, чтобы оценить всю познавательную мощь и информативность этого метода исследоваметодологические аспекты самосборки ния. Еще большее значение этот подход имеет примемембран при реконструкции.

нительно к биологическим мембранам, поскольку они представляют собой чрезвычайно сложные многокомjournal.issep.rssi.ru понентные системы, которые исключительно гетерогенны по своему составу и структурной организации.

СОРОСОВСКИЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЖУРНАЛ, ТОМ 8, №1, Барсуков Л.И., © БИОЛОГ ИЯ Первые усилия по разделению мембран на отдель- растворы. Поверхностная активность детергентов, то ные функциональные единицы были предприняты в есть способность адсорбироваться на границе раздела 60-е годы XX в., и в течение долгого времени это на- фаз (типа вода–воздух или вода–масло), связана с амправление развивалось эмпирически, по принципу фифильностью их молекул. Амфифильными (от греч.

проб и ошибок. Были испытаны различные способы фило – любящий и амфи – обоих) называют вещества, воздействия на мембрану, включая механическую об- в молекулах которых имеются четко разграниченные работку, действие ультразвука, использование органи- гидрофильные и гидрофобные области, благодаря чему ческих растворителей и разнообразных химических такие молекулы обладают сродством не только по отагентов. Хотя в ряде случаев с помощью этих методов ношению к воде, но и к неполярным органическим были достигнуты определенные положительные ре- растворителям.

зультаты, однако чаще всего такая обработка либо была В воде молекулы детергентов стремятся ассоциималоэффективной, либо приводила к деструкции мемровать друг с другом, давая мицеллы (рис. 1). Эти агребранного материала и, что хуже всего, к необратимой гаты состоят из большого числа детергентных молекул денатурации мембранных белков. И только лишь после (обычно от нескольких десятков до нескольких сот), введения детергентов в практику мембранных исследоориентированных в мицелле таким образом, что их неваний был найден тот золотой ключик, с помощью кополярные группы формируют внутреннее гидрофобторого удалось раскрыть главные секреты структуры и ное ядро мицеллы, а гидрофильные полярные группифункций биологических мембран.

ровки находятся на ее поверхности и контактируют с окружающими молекулами воды. Именно благодаря наличию гидрофобного ядра мицеллы способны солюНЕМНОГО О ДЕТЕРГЕНТАХ билизировать, то есть переводить в раствор неполярПрежде чем мембрану собрать, надо суметь разоные вещества, практически нерастворимые в воде.

брать ее на составные части. Оказалось, что легче всего В настоящее время известно несколько сот различэто сделать с помощью детергентов.



ных детергентов. Все они разделяются на два основных Детергенты (от лат. detergere – мыть, очищать) класса: ионные и неионные детергенты в зависимости представляют собой поверхностно-активные вещества от наличия или отсутствия заряженных групп в гидрос моющим действием, которое обусловлено их способ- фильной области их молекул. В свою очередь, по типу ностью образовывать в воде устойчивые коллоидные заряда ионные детергенты делятся на катионные, Сферические мицеллы Эллипсоидальные мицеллы Цилиндрические мицеллы Рис. 1. Различные типы мицелл, образуемых детергентами в воде в зависимости от их химического строения, концентрации и условий среды. Сферические мицеллы имеют минимальные размеры (около 4 нм) и обычно существуют в области концентраций, ненамного превышающих ККМ. С ростом концентрации детергента сферические мицеллы переходят в цилиндрические (или палочкообразные) мицеллы, средняя длина которых зависит от концентрации детергента. Эллипсоидальные мицеллы образуют детергенты, у которых соотношение между размерами полярной и неполярной областей молекулы может меняться, а также детергенты в смеси с другими амфифильными соединениями (рисунок из [3]) БАРСУКОВ Л.И. КАК СОБРАТЬ МЕМБРАНУ (СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ И РЕКОНСТРУКЦИЯ МЕМБРАН) БИОЛОГ ИЯ имеющие положительный заряд, анионные, обладаю- зовывать мицеллы. До этого он находится в воде в мощие отрицательным зарядом, и цвиттер-ионные, у ко- номерной форме в состоянии истинного раствора. Чисторых имеется как положительный, так и отрицатель- ло агрегации показывает, сколько молекул детергента ный заряд, и поэтому в целом молекула является приходится на одну мицеллу.

электрически нейтральной.

В мембранных исследованиях используют довольВ качестве параметров, характеризующих способ- но ограниченный круг детергентов. В табл. 1 представность детергентов к мицеллообразованию, обычно ис- лены те из них, которые чаще всего применяются для пользуют критическую концентрацию мицеллообразо- солюбилизации и реконструкции мембран. Для этих вания (ККМ) и число агрегации. ККМ – это та детергентов характерны довольно высокие значения концентрация, при которой детергент начинает обра- ККМ (10-4–10-2 М) и то, что они относятся к разряду Таблица 1. Детергенты, наиболее часто используемые для солюбилизации и реконструкции мембран (из [3]) Структурная формула Название O H3C O-Na+ HO CHХолат натрия H3C (3, 7, 12-тригидрокси-5-холанат натрия) HO OH H O CH3 O H3C N N+ S OHOCHH CH3 O ЧАПС (3-[(3-холамидопропил)-диметиламмонио]H3C пропансульфонат) HO OH H CHO H3C H3C O Дигитонин H3C HO OH Glu–Glu–Gal–Gal–Xyl O H CH2OH O O Октилглюкозид (октил--D-глюкопиранозид) HO OH OH CH3 CHCH3 CHТритон Х-100 п-(трет-октил)-фениловый эфир полиэтиленгликоля (O–CH2–CH2)9–10–OH (O–CH2–CH2)9–10–OH Луброл РХ (додециловый эфир полиэтиленгликоля) СОРОСОВСКИЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЖУРНАЛ, ТОМ 8, №1, БИОЛОГ ИЯ так называемых мягких детергентов, то есть таких, которые не нарушают активности мембранных белков и не вызывают их денатурации или делают это в минимальной степени.

Вообще говоря, выбор детергента для реконструкции мембраны, как правило, представляет сложную заКонус Мицеллы дачу, поскольку заранее трудно предсказать, насколько удачным окажется данный детергент для данной конкретной мембраны и для данного конкретного белка.

Кроме того, нередко требования к детергенту, используемому для солюбилизации мембраны, отличаются от требований, предъявляемых к детергенту при реконструкции. Поэтому иногда приходится в ходе экспериЦилиндр Липидный бислой мента заменять один детергент на другой или использовать смеси разных детергентов.

Рис. 2. Схематичное изображение формы амфифильных молекул, наиболее склонных к образованию сферических и цилиндрических мицелл или ПОЧЕМУ И КАК ДЕТЕРГЕНТЫ плоского бимолекулярного слоя. На рисунке показаРАЗРУШАЮТ МЕМБРАНУ но поперечное сечение мицелл и липидного бислоя (модифицированный рисунок из [3]) Большая часть тех веществ, из которых построены биологические мембраны, а это главным образом белстоль велики. В силу этого они имеют форму цилиндра ки и липиды, практически нерастворимы в воде. Это (или бруска) и лучше всего упаковываются в протяженсвязано не с тем, что эти вещества являются абсолютно ные липидные бислои минимальной кривизны. Поэтогидрофобными. Напротив, и мембранные липиды, и му при одновременном присутствии детергента и лимембранные белки содержат в составе своих молекул пида в составе одного агрегата возникает конфликт довольно обширные области, образованные гидромежду стремлением детергента принять мицеллярную фильными группировками, а потому, как и детергенты, конфигурацию и тенденцией липида сохранить бислойявляются амфифильными. Весь секрет заключается в ную упаковку молекул в мембране.

балансе гидрофильных и гидрофобных остатков в молекулах этих соединений. А он таков, что величины Пока детергента в мембране мало, его присутствие ККМ для этих веществ очень малы (10-10–10-9 М), и в проявляется лишь в возникновении дефектов упаковводе их молекулы проявляют мощную тенденцию к агки молекул в липидном бислое с образованием пор, регации. Однако в силу особенностей своего строения проницаемых для водорастворимых соединений. Но по (см. ниже) они образуют в воде не маленькие мицеллы, мере роста содержания детергента изменения упаковки а протяженные мембранные агрегаты. В этих структустановятся все более значительными и в конечном счерах неполярные участки молекул формируют гидроте вызывают нарушения целостности мембраны, что фобную область мембраны, которая изолирована от приводит к ее разрывам и даже к фрагментации на отводы гидрофильными группами, расположенными на дельные частицы. Однако эти частицы все еще сохрапротиволежащих друг другу поверхностях мембранноняют мембранную организацию, и вся система в целом го бислоя.





по-прежнему может рассматриваться как раствор деПочему же детергенты разрушают мембрану Да тергента в мембране.

потому, что молекулы, образующие мицеллы, и молекулы, склонные к формированию мембран, предъяв- Когда же концентрация детергента в мембране доляют разные требования к геометрии образуемых ими стигает некоторой критической величины и дальнейшее ассоциатов (рис. 2).

сохранение бислойной организации молекул становится энергетически невыгодным, мембрана начинает Молекулы детергентов, обладающие довольно объразрушаться с образованием смешанных липид-детеремной гидрофильной областью и относительно негентных и белок-детергентных мицелл, которые фактибольшим гидрофобным участком, в целом имеют форчески представляют собой раствор компонентов мембму конуса и поэтому легко упаковываются в структуры раны в избытке детергента (рис. 3). Это и есть момент с высокой кривизной поверхности типа сферических или цилиндрических мицелл. В свою очередь, в липид- солюбилизации, которая приводит к резкому уменьшеных молекулах, образующих мембраны, различия в нию размера частиц и как следствие этого – к снижеразмерах гидрофильной и гидрофобной области не нию мутности мембранной суспензии и уменьшению БАРСУКОВ Л.И. КАК СОБРАТЬ МЕМБРАНУ (СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ И РЕКОНСТРУКЦИЯ МЕМБРАН) БИОЛОГ ИЯ Детергентно-липидные мицеллы Детергент Детергент Детергентно-белковые Липидно-белковая мембрана Фрагментация мицеллы Детергентные мицеллы Рис. 3. Солюбилизация мембран с помощью детергентов. Добавление детергента приводит к разрушению мембраны с образованием смешанных детергентно-липидных и детергентно-белковых мицелл (модифицированный рисунок из [3]) количества материала, осаждаемого при центрифуги- ПОЧЕМУ И КАК МЕМБРАНА СОБИРАЕТСЯ ровании.

Собственно говоря, сборка мембран происходит в Для солюбилизации лучше использовать детергенсоответствии с теми же принципами, что и их разборка.

ты с низкой ККМ, так как такие детергенты легче Если содержание детергента в смешанных мицеллах встраиваются в мембрану и быстрее вызывают ее расуменьшать, то стремление солюбилизированных в них пад до смешанных мицелл. В этом качестве наиболее молекул к мембранному типу упаковки заставит миэффективны ионные детергенты, но их недостатком целлы сливаться друг с другом и в какой-то момент, является то, что нередко они вызывают денатурацию когда оставшегося детергента станет уже недостаточно белков. Особенно часто это происходит в случае катидля сохранения высокой кривизны поверхности в онных детергентов. Иногда денатурацию можно преукрупнившихся мицеллярных агрегатах, они преврадотвратить добавив липид в белковый солюбилизат.

щаются в мембранные структуры.

Неионные детергенты менее эффективны в качестве Таким образом, процессы солюбилизации и реконсолюбилизирующих агентов и иногда не полностью отструкции мембраны зеркально симметричны в смысле деляют липиды от белков. Но, возможно, именно пообратимости превращений, происходящих при измеэтому в присутствии неионных детергентов белки лучнении содержания детергента в смеси. Более того, они ше сохраняют свою активность.

протекают самопроизвольно, если концентрация деВ солюбилизированном состоянии мембранные тергента становится выше или ниже определенного белки можно легко отделить от основной массы липипредела. Единственное, что требуется, чтобы запустить дов и подвергнуть дальнейшему фракционированию с процесс реконструкции, – это знать, каким образом целью выделения индивидуального белка или группы можно удалить детергент из имеющегося солюбилизата.

белков с интересующим исследователя типом активноВ принципе с этим тоже нет больших проблем, пости. Методы такого фракционирования в настоящее скольку сейчас имеется широкий набор различных время хорошо отработаны и включают специальные способов удаления детергентов. Выбор подходящего приемы разделения белков с помощью гель-фильтраспособа определяется задачами реконструкции, а такции, хроматографии и электрофореза в водном буфере, же типом детергента, который необходимо удалить.

содержащем детергент в концентрации, равной или Чаще всего используются четыре основных способа превышающей его ККМ. В некоторых случаях солюбиудаления детергента: диализ, гель-фильтрация, сильлизированные препараты выделенных мембранных ное разбавление солюбилизата и адсорбция детергента белков можно использовать для проведения структурна гидрофобных полимерах.

Pages:     || 2 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.