WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 24 |

2. На постоянных препаратах изучить этапы микроспорогенеза и мегаспорогенеза, сделать рисунки в тетрадях. Описать рисунки по этапам.

Материалы и оборудования 1. Фиксированные доведенные до 70 процентного спирта проростки семян гороха, молодые корешки и бутоны лука, гороха, вишни.

2. Тигельки для окрашивания, спиртовки, предметные и покровные стекла, препаровальные иглы, лезвия.

3. Капельницы, глицерин, вода, 45% уксусная кислота, ацетокармин.

4. Постоянные препараты срезов пыльника, различных стадий микроспорогенеза, срезов завязи различных стадий развития зародышевого мешка.

5. Микроскопы.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Тема 5. Опыление, оплодотворение Опыление – перенос образовавшейся в пыльниках пыльцы на рыльце.

Различают самоопыление – автогамия и перекрестное опыление – ксеногамия.

Самоопыление происходит в пределах одного цветка, а может происходить опыление в пределах растения, т.е. каждый цветок опыляется пыльцой других цветков, той же особи (того же сорта). К самоопыляющимся относятся: ячмень, пшеница, овес, горох, томат, перец, малина, смородина и т.д.

Перекрестное опыление – это перенос пыльцы с тычинок одного сорта на рыльце пестика другого сорта. К перекрестноопыляемым относятся: рожь, кукуруза, редис, капуста, свекла, яблоня, груша и т.д.

У покрытосеменных происходит двойное оплодотворение, которое заключается в том, что на рыльце пестика попадает двухядерная или трехядерная пыльца. Пыльца при определенных условиях прорастает, образуя пыльцевую трубку у двухядерной пыльцы в пыльцевой трубке, (когда пыльцевая трубка растет в тканях столбика) происходит деление генеративной клетки митозом и образуется два спермия. Как только пыльцевая трубка проникает в микропиле и достигает зародышевого мешка синергиды выделяют ферменты, растворяющие кончик пыльцевой трубки и свободные спермии проваливаются в зародышевый мешок. Один спермий сливается с диплоидной центральной клеткой образуется триплоидный эндосперм. Другой спермий сливается с яйцеклеткой образуется диплоидный зародыш. Покровы семени образуются из покровов семяпочки.

Тема 6. Определение жизнеспособности пыльцы и её фертильности Из методов испытания жизнеспособности пыльцы в селекционных и сортоведческих работах основное значение имеет метод проращивания пыльцы в искусственной питательной среде и наблюдение за прорастанием пыльцы непосредственно на рыльцах пестика, а также методы окрашивания, рекомендуемые для свежесобранной пыльцы.

Методы проращивания пыльцы в искусственной среде 1. Метод влажной камеры (Ван-Тигема, Д.А. Транковского) основан на способности пыльцы плодовых растений прорастать в водном растворе сахарозы или глюкозы.

Камера Ван-Тигема состоит из предметного стекла, на котором при помощи вазелина прикрепляется стеклянное кольцо диаметром около PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 1,5 см и высотой 7-8 мм. На дно камеры помещают небольшую каплю воды, а верхний край кольца смазывают вазелином. Затем на нижнюю поверхность покровного стекла с помощью стеклянной палочки наносят каплю питательной среды для проращивания пыльцы. Для посева пыльцы плодовых растений обычно берут концентрации раствора сахарозы – 5%, 10% и 15%. На каплю питательной среды высевают исследуемую пыльцу.

Пыльца набирается на кончик препаровальной иглы или пинцета и осторожно стряхивается на поверхность капли. При посеве пыльцы следует избегать погружения иглы в каплю раствора. Будучи рассеяны по поверхности капли, пыльцевые зерна находятся в более однородных условиях и расположены почти в одной плоскости, вследствие чего облегчается наблюдение под микроскопом. Нужно стараться, чтобы в пределах одной капли было рассеяно около 100 пыльцевых зерен (густой посев благоприятно влияет на прорастание пыльцы). После посева покровное стекло перевертывают каплей вниз и накрывают им стеклянное кольцо так, чтобы стекло плотно прилегало к краям кольца, смазанным вазелином. Капля с посеянной пыльцой должна находиться в висячем положении посредине, не соприкасаясь с краями камеры, иначе она растекается (рис. 13).

Рис. 13. Влажная камера Ван-Тигема с посеянной пыльцой.

Наличие капли воды на дне такой герметичной камеры обеспечивает поддержание в ней необходимой влажности. На приклеенной к предметному стеклу бумажной этикетке записывают необходимые сведения: происхождение пыльцы, концентрация раствора, дата и время посева, фамилия студента. При посеве пыльцы по методу Д.А. Транковского, который получил в последнее время широкое применение, посев проводится в капле питательной смеси, которая нанесена на предметное стекло (рис. 14), после чего стекла с посеянной пыльцой помещаются на подставки во влажную камеру – чашки Петри. (Опыт показал, что капли с питательной среPDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com дой можно наносить прямо на внутреннюю сторону крышки чашки Петри, без предметных стекол). Для увлажнения на дно чашки Петри кладется смоченная водой фильтровальная бумага и закрывается крышкой.

Рис. 14. Посев пыльцы.

Влажные камеры с посеянной пыльцой держат в затемненном месте.

Пыльца прорастает вполне удовлетворительно при температуре от 12 до 24 (оптимальная температура +18-20С).

В микроскоп пыльцу рассматривают обычно через сутки после посева, но при температуре +20-24С для прорастания бывает достаточно 4-часов. Камеру или чашку Петри помещают на предметный столик микроскопа, рассматривают проросшую пыльцу и подсчитывают проросшие и непроросшие пыльцевые зерна. Во внимание принимаются только пыльцевые зерна, находящиеся в пределах капли. Пыльца, попав в питательный раствор, набухает и становится более округлой. По этому признаку их легко отличить от пыльцевых зерен, оказавшихся на сухой части стекла. Процент проросших пыльцевых зерен определяют не менее, чем в 3-х полях зрения, путем подсчета в каждом поле зрения проросших и не проросших пыльцевых зерен. Вычисляется процент прорастания (рис. 15).



PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Рис. 15. Проросшая пыльца яблони в растворе сахарозы (в поле зрения микроскопа).

Метод испытания жизнеспособности пыльцы путем посева в искусственной среде имеет существенный недостаток: пыльца проращивается в условиях, резко отличных от естественных. Вследствие этого наблюдаемая картина может в более или менее сильной степени отличаться от прорастания той же пыльцы на рыльцах опыленных цветков. Однако добавление к сахарному раствору (0,0005 – 0,001% борной кислоты, агар-агара) или введение в каплю отделенного от пестика рыльца растения того же ботанического вида несколько приближает к естественным условиям, но полностью устранить указанный недостаток не может.

Оценка жизнеспособности пыльцы на рыльцах опыленных цветков Для более достоверной оценки жизнеспособности пыльцы несомненное значение имеет наблюдение над ее прорастанием непосредственно на рыльцах опыленных цветков.

С этой целью опыленные цветки через 1-2 суток после опыления фиксируются. При фиксации у цветка удаляется околоцветник пинцетом или ножницами. Если для изучения используется различная пыльца, то пестики различных комбинаций скрещивания помещаются либо в марлевые салфетки, на которые привешиваются этикетки с обозначением номера комбинации, либо пестики помещаются в отдельные пробирки.

Перед изучением верхнюю часть столбика с рыльцем отрезают ножницами или отщипывают пинцетом. Для того, чтобы пыльцевые трубки можно было легко различить среди сосочков рыльца проводят окрашивание метиленовой синью. Раствор приготавливают в дистиллированной воде концентрацией примерно от 0,01 до 0,1%. В результате окрашивания пыльцевые зерна и трубки ясно выделяются среди сосочков рыльца (рис.

16).

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Рис. 16. Проросшая пыльца на рыльцах пестика.

Отделенную часть столбика с рыльцами помещают в каплю раствора метиленовой сини на предметное стекло, через 1-2 минуты краску удаляют фильтровальной бумагой и добавляют каплю глицерина, накрывают покровным стеклом и раздавливают, нажимая на покровное стекло пальцем.

При изучении прорастания пыльцы на рыльцах подсчитывают число проросших и непроросших пыльцевых зерен и определяют процент проросших. Этот метод также имеет недостатки. Непроросшие зерна плохо удерживаются на рыльцах и легко смываются при погружении в раствор краски или в фиксирующую жидкость. По этой причине завышается процент проросших пыльцевых зерен по сравнению с действительностью.

2. Метод В.С. Шардакова основан на том, что жизнеспособная пыльца содержит в большом количестве фермент пероксидазу, а поэтому легко дает окрашенное соединение при действии реактивов, содержащих бензидин. Нежизнеспособная пыльца не содержит пероксидазы, а поэтому не окрашивается.

Для проведения исследования жизнеспособности пыльцы в отдельных склянках из оранжевого стекла готовят четыре раствора.

1. 0,20 г бензидина основного в 100 мл 50%-го раствора этилового спирта;

2. 0,15 г нафтола в 100 мл 50%-го раствора этилового спирта;

3. 0,25 г натрия углекислого в 100 мл дистиллированной воды;

4. 0,3% раствор перекиси водорода.

Непосредственно перед употреблением растворы (1, 2 и 3) смешивают в небольших равных объемах. Эту смесь растворов и 4-й раствор наливают в отдельные капельницы.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Пыльцу помещают на предметное стекло и пипеткой прибавляют каплю смеси растворов (1, 2, 3) и через одну минуту добавляют каплю раствора 4. Перемешивают стеклянной палочкой и накрывают покровным стеклом.

Для плодовых и ягодных растений просмотр проводится сразу после нанесения капли раствора 4. Если многочисленные пузырьки выделившегося кислорода будут мешать изучению препарата, то их удаляют приподнятием покровного стекла. Живая пыльца окрашивается в ярко-розовый или темно-красный цвет благодаря наличию пероксидазы, а мертвая останется бесцветной или желтоватой. Подсчеты проводят не менее, чем в 3-х полях зрения.

Для свежесобранной пыльцы этот метод дает удовлетворительные результаты, но для хранившейся пыльцы результаты получаются несколько завышенные.

Определение фертильности пыльцевых зерен Принято различать жизнеспособность и оплодотворяющую способность пыльцевых зерен. По определению Уолдена и Эверетта, жизнеспособность пыльцевых зерен - это способность мужского гаметофита к росту на соответствующих тканях пестика, а оплодотворяющая способность, или зиготический потенциал пыльцевого зерна – способность его вызывать полное оплодотворение. Оплодотворяющую способность пыльцевых зерен еще называют фертильностью. Наиболее надежное определение жизнеспособности и фертильности дают методы in vivo. Для сравнительных оценок можно применять и те, которые основаны на реакциях окрашивания.

Для определения фертильности пыльцевых зерен используют два метода:

ацетокарминовый и йодный.





Ацетокарминовый метод. Фиксируют соцветия или цветки со зрелой пыльцой в фиксаторе Карнуа. Продолжительность фиксации колеблется от 30 мин до нескольких часов. Материал промывают и хранят в 80%-м растворе этилового спирта. После хранения пыльник выкладывают на предметное стекло и раздавливают в капле ацетокармина. Убрав лишние ткани, препарат накрывают покровным стеклом и осторожно подогревают на спиртовке.

Можно определить фертильность пыльцы ацетокарминовым методом без предварительной фиксации, т.е. используя свежие пыльники. Нередко материал фиксируют в уксусном алкоголе (3: 1), а затем пыльцевые зерна сразу окрашивают ацетокармином.

У фертильных пыльцевых зерен зернистая цитоплазма и спермии окрашены в густой карминово-красный цвет. Стерильные пыльцевые зерна почти не окрашиваются ацетокармином или окраска неравномерна. Их содержимое часто отходит от оболочки и находится на разных стадиях отмирания. Спермиев в таких пыльцевых зернах нет (рис. 17).

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Рис.17. Пыльцевые зерна пшеницы после окраски ацетокармином:

А — фертильное; 1 - спермии; Б — стерильное пыльцевое зерно: 1 - содержимое пыльцевого зерна отошло от оболочки; 2- погибающие вегетативное и генеративное ядра.

Йодный метод. У некоторых культур, например у гречихи, пыльцевые зерна имеют толстую экзину, через которую трудно увидеть спермии при окрашивании ацетокармином. Удобнее йодный метод определения фертильности пыльцы. В основе его лежит определение крахмала при помощи йодной реакции. Фертильные и стерильные пыльцевые зерна отличаются по содержанию крахмала. Обычно фертильное пыльцевое зерно гречихи полностью заполнено крахмалом, а стерильное не имеет его совсем или содержит следы.

Приготовление реактива. Йодный раствор готовят по рецепту Грама: 2 г йодида калия растворяют в 5 мл дистиллированной воды при нагревании. Затем в раствор добавляют 1г металлического йода, доводят до мл и хранят в склянке из оранжевого стекла.

Зрелые пыльники вскрывают двумя иглами на предметном стекле, смачивают йодным раствором и, удалив лишние ткани, накрывают покровным стеклом. Под микроскопом можно легко отличить фертильные пыльцевые зерна по темно-фиолетовому (почти черному) цвету. Стерильные пыльцевые зерна остаются неокрашенными, так как не содержат крахмала или имеют его следы. Неокрашенными оказываются и оболочки пыльцевых зерен.

Однако обнаружено также, что пыльцевые зерна, несущие спермин, не всегда фертильны, даже если в них есть крахмал.

Объекты 1. Пыльца различных плодовых, ягодных растений и полевых культур.

2. Зафиксированные, опыленные пестики плодовых, овощных, полевых культур.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Оборудование, инвентарь, материалы 1. Биологические микроскопы 2. Окуляр с указателем 3. Сетчатые окуляр-микрометры 4. Пинцеты с острыми концами 5. Препаровальные иглы 6. Предметные стекла с приспособлениями для влажных камер 7. Покровные стекла 8. Стеклянные палочки 9. Дистиллированная вода 10. Вазелин чистый 11. Растворы сахарозы 12. Метиленовая синь, ацетокармин, йодный раствор 13. Растворы для окраски пыльцы по методу Шардакова 14. Фильтровальная бумага 15. Глицерин 16. Чашки Петри 17. Фильтры Тема 7. Люминисцентный метод определения жизнеспособности пыльцы Метод люминисцентной микроскопии позволяет проанализировать прогамную и постгамную этапы процесса оплодотворения.

Метод люминисцентной микроскопии основан на том, что некоторые вещества при освещении коротковолновыми лучами (ультрафиолетовыми, рентгеновскими и др.). Способны люминисцировать, т.е. светиться желтозеленым или оранжевым светом. Способность веществ излучать свет называется первичной люминисценцией. Если вещество нелюминисцирует, то его можно обработать специальными красителями – флюорохромами. В этом случае наблюдается вторичная или наведенная люминисценция. Наблюдать люминисценцию можно в обычном биологическом микроскопе при помощи специального устройства ОИ-17 с ртутной лампой, в качестве источника света. Но удобнее всего для этой цели пользоваться и люминисцентными микроскопами: МЛ-2, МЛ-3, МЛ-4. У этих микроскопов источником света служит кварцевая или ртутно- кварцевая лампа.

Для приготовления препаратов предварительно проводится опыление цветков различных плодовых культур пыльцой другого сорта. Затем опыленные цветки темпарально фиксируются: через час, 6 часов, 24 часа, 48, 72 часа после опыления.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com I. Фиксация:

В качестве фиксатора для этих целей лучше использовать фиксатор Чемберлена, который состоит: из 5 частей 40% формалина; 5 частей ледяной уксусной кислоты и 90 частей 70% этилового спирта или фиксатор Карнуа: (100мл спирта – ретификата 90-96 %, 10мг хлороформа, 10 капель ледяной уксусной кислоты). В фиксаторе материал может находиться долго, минимальное время фиксации 12 часов. Фиксацию проводят в бюксах или пенициллиновых флаконах, можно пестики помещать в марлевые салфетки, куда помещается этикетка с указанием объекта и времени фиксации. Салфетки с пестикоми помещают в банку с притертой пробкой и заливают фиксатором. После фиксации материал может долго хранится в 75% спирте.

II. Промывка, мацерация, окрашивание:

1. Слить 75 % спирт в баночку.

2. Однократная промывка пестиков водопроводной водой.

3. Мацерация в 1н NaOH – 9 часов (или 2н NaOH – 6 часов). Готовим раствор из расчета: 40г на 1л, т.е. 12г NaOH на 300мл дистиллированной воды.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 24 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.