WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 24 |

Приготовление постоянных препаратов Для усвоения последовательных этапов с учетом определенных условий во времени и используемых материалов для обработки, каждому студенту дается индивидуальное задание по составлению календарного плана приготовления постоянных препаратов (объект и дата фиксации материала).

Ниже приводится схема последовательных этапов обработки материала, приготовления постоянных микротомных препаратов.

Составление календарного плана приготовления постоянных препаратов В календарном плане в каждой операции указывается по часам начало работы и её завершение.

1. Подготовка материала к фиксации (проращивание луковицы и т.д.) – 1-3 суток.

2. Фиксирование материала (водный фиксатор) – 24 часа.

3. Промывка в проточной воде – 1-3 часа.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 4. Обезвоживание материала (выдерживание в спиртовых растворах).

а) спирт 20 % б) спирт 40 % по 30 мин. в каждом в) спирт 60 % г) спирт 80 % В 80 % спирте материал можно оставить на ночь или на более продолжительный срок.

5. Полное обезвоживание материала а) спирт 96% - 1 - 1 час б) спирт 96% - 11 - 1 час в) спирт 100% - 1 - 1 час г) спирт 100% - 1 - 1 час 6. Замещение спирта на растворитель парафина а) 1 часть ксилола + 3 части спирта – 1 час б) ксилол + спирт 1:1 - 1 час в) ксилол + спирт 3:1 - 1 час г) ксилол 1 - 1 час д) ксилол 11 - 1 час 7. Добавляем в ксилол парафин до полного насыщения (с избытком) – 10 мин.

8. Помещаем смесь в термостат в закрытом сосуде при 56-57О С для пропитывания материала смесью парафина и ксилола – 1 сут. (можно и дольше).

9. Открываем крышку сосуда для испарения ксилола (до исчезновения запаха ксилола) – 3-6 сут.

10. Остужаем сосуд с парафином и извлекаем «Пряник» – 10 мин.

материал, залитый в парафин можно хранить долго.

11. Изготовление блока – 15 мин.

12. Получение срезов на микротоме – 10 мин.

13. Наклеивание ленты на предметное стекло – 10 мин.

14. Просушивание препарата при 400С не менее 12 час (можно при выключенном термостате хранить долго).

15. Удаление парафина со срезов: обмываем срезы ксилолом из капельницы и ставим стекло на 30 мин. в ксилол.

16. Переносим стекло в свежий ксилол на 5 мин.

17. Удаление ксилола со срезов: обмываем срезы 96% спиртом из капельницы и ставим стекло на 5 мин в 96 % спирт.

18. Промываем стекла в трех сменах дистиллированной воды – по 5 мин.

19. Протравливание (для лучшего окрашивания материала) – 4-час в растворе 4% железоаммонийных квасцов.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 20. Промывка в двух сменах дистиллированной воды по 5 мин.

21. Окрашивание: в растворе гематоксилина (0,1-1%) – 12 час (можно на ночь).

22. Промывка в воде – 15 мин.

23. Дифференцировка (удаление лишнего красителя) срезов в 2% растворе железоаммонийных квасцов - 5 мин.

24. Промывка препарата в воде – 30 мин.

25. Обезвоживание окрашенных срезов: 96% спирт – 10 мин.

100% спирт – 10 мин.

26.Удаление спирта: ксилолом 1 – 10 мин.

ксилолом 11 – 10 мин.

27.Заключение в бальзам - наклейка покровных стекол – 5 мин.

28.Сушка препаратов – 3 суток.

29.Наклеивание этикеток на стекла с препаратами – 5 мин.

Календарный план проверяется преподавателем индивидуально у каждого студента.

Тема 4. Методика приготовления временных «давленных» препаратов В настоящее время разработаны ускоренные методики в микроскопической технике. Так, приготовление давленных препаратов не требует той сложной обработки материала, которая обязательна при приготовлении постоянных микротомных препаратов.

Давленные препараты могут использоваться при изучении митоза, кариотипов, хромосомных нарушений в корешках и конусах нарастания стеблей; мейоза - в молодых пыльниках различных растений.

Для приготовления давленных препаратов используют фиксатор Карнуа – уксусный алкоголь (6 частей абсолютного спирта + 3 части хлороформа + 1ч ледяной уксусной кислоты) или фиксатор Кларка – уксусный алкоголь (3 части абсолютного спирта + 1 часть ледяной уксусной кислоты). Окрашивание препарата можно проводить различными красителями:

ацетокармином, ацетоарсеином, ацетолакмоидом, метиленовой синькой.

Чаще используют для окрашивания ацетокармин, приготовленный следующим образом. 1г кармина растворяют в 45 мл ледяной уксусной кислоты и 55 мл дистиллированной воды. Растворение ведется в колбе с обратным холодильником на водяной бане в течение 30-60 минут. После остывания раствор кармина фильтруют и помещают в посуду с притертой пробкой.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Последовательные этапы приготовления давленных препаратов.

1. Фиксация в уксусном алкоголе.

2. Промывка материала в 70%-ном спирте до исчезновения запаха уксусной кислоты.

3. Хранение материала в 70%-ном спирте.

4. Промывка материала в воде.

5. Материал помещают в краситель на 3-5 минут и подогревают на спиртовке (объект доводят до кипения).

6. Окрашенный объект кладут на предметное стекло в каплю 45%-ной уксусной кислоты или раствора хлоралгидрата, покрывают покровным стеклом и фильтровальной бумагой, постукивают сверху спичкой или слегка раздавливают пальцем до образования мазка.

Готовые препараты можно окантовать парафином, лаком (для их более длительного использования).

4.1 Деление клеток (митоз, мейоз) Митоз. Деление соматических клеток многоклеточного организма осуществляется, как правило, у растений путём митоза. Происходит митоз у растений в точках роста стебля и корня.



В результате митоза из одной клетки образуется две дочерние клетки, генотипически сходные как между собой, так и с исходной материнской клеткой.

Период от начала одного деления до другого и совокупность процессов, происходящих при этом в клетке, называются митотическим циклом.

В процессе митотического цикла, включающего интерфазу и собственно митоз, происходит сначала удвоение, а затем точное распределение между двумя дочерними клетками наследственной информации, закодированной в молекулах ДНК хромосом.

Хромосомы – это плотные нитевидные образования, которые становятся видимые при делении клетки. Без окрашивания хромосомы не видны в обыкновенный световой микроскоп.

Совокупность хромосом диплоидного набора представляет собой кариотип. Для каждого кариотипа характерно: определенное количество хромосом (человек – 2n-46; курица – 2n-24; лук репчатый – 2n-16; горох посевной - 2n-14; пшеница мягкая – 2n-42; пшеница твердая – 2n-28; рожь – 2n-14; яблоня – 2n-34 и т.д..), размер, форма и структура.

Хромосома состоит из двух хроматид соединенных центромерой. В зависимости от места расположения центромеры различают: метацентрические (центромера расположена в центре хромосом) – равноплечие, субметацентрические - неравноплечие (центромера сдвинута к одному из концов хромосомы), акроцентрические – палочковидные (центромера сдвинуPDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com та к концу хромосомы или очень близко от него) (рис. 10). Каждая хромосома состоит из гетеро- и эухроматиновых участков. При дифференцированном окрашивании можно наблюдать не только форму, размер, но и функциональную активность отдельных районов хромосом по интенсивности окраски гетеро- и эухроматиновых участков.

Рис. 10. Разные типы метафазных хромосом:

1,7 - метацентрические (равноплечие); 2 - субмета-центрические (слабо неравноплечие); 3, 4, 5 - акро-центрические (резко неравноплечие); 6 - телоцентрическая (центромера почти на самом конце): 8 - акро-центрическая со вторичной перетяжкой; 9 - спутничная; центромеры обозначены светлым кружком.

Каждая хромосома состоит из 2-х хроматид, каждая хроматида состоит из хромонем. При делении клетки в стадии профазы и метафазы митоза на хромонемах можно видеть плотные образования (в виде узелков) – хромомеры. Кроме обычных хромосом в некоторых клетках обнаружены гигантские хромосомы, образующиеся в результате эндомитоза. Имеется еще и другая группа хромосом – хромосомы типа ламповых щеток, они имеют центральную ось и боковые выросты.

По химическому составу хромосомы представляют нуклеопротеид, состоящий из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), гистоновых и негистоновых белков.

Рис 10. Митотический цикл и фазы митоза:

4 – интерфаза, 5,6 – профаза; 7 – метафаза; 8 – анафаза; 9 – телофаза; 10 – цитокинез.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Состояние клеток между делениями называется интерфазой, в которой различают три периода: G1 – предсинтетический, S– период синтеза, G2 – постсинтетический. Период G1 – энергетический период, когда накапливаются богатые энергией вещества, S – период связан с удвоением генетического материала, путем репликации молекулы ДНК, G2 - период связан со спирализацией молекулы ДНК, синтезом белков.

В митозе различают четыре последовательно идущие фазы: профаза, метафаза, анафаза, телофаза, завершается деление цитокинезом (рис.10).

Профаза: ядро увеличивается в размере, хроматиновые нити спирализуются и приобретают форму, присущую хромосомам данного вида; каждая хромосома состоит из двух хроматид, спирально скрученных и соединенных центромерой. Ядерная оболочка и ядрышко исчезают.

Метафаза: ядерная оболочка полностью фрагментируется, хромосомы достигают максимальной спирализации и приближаются к экватору клетки, располагаясь в одной плоскости образуя метафазную пластинку.

Заканчивается формирование митотического веретена и осуществляется прикрепление нитей ахроматинового веретена к центромерам хромосом.

Центромеры всех хромосом делятся.

Анафаза: после деления центромер хроматиды отталкиваются одна от другой и расходятся к разным полюсам. Хроматиды при этом уже называются сестринскими хромосомами.

Телофаза: сестринские хромосомы концентрируются на полюсах, деспирализуются, утрачивая видимую индивидуальность. Одновременно формируется ядрышко, ядерные оболочки и оболочка клетки: последняя делит содержимое исходной клетки между двумя дочерними клетками.

Формирование двух дочерних клеток получило название цитокинеза.

После цитокинеза клетка может вступать в следующий митотический цикл.

Мейоз – особый вид деления клеток, связанный у растений с делением материнских клеток и образованием микроспор и мегаспор. В результате мейоза у растений образуются споры, в клетках которых число хромосом уменьшается вдвое, т.е. становится гаплоидным.

Мейоз состоит из двух последовательных делений: первое деление – редукционное, в результате которого число хромосом в дочерних клетках уменьшается вдвое, т.е. становится гаплоидным; второе деление – эквационное (протекает по типу митоза). В каждом мейотическом делении различают стадии: интерфазу, профазу, метафазу, анафазу, телофазу и цитокинез. Состояние клеток между первым и вторым делениями получило название интеркинеза.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Интерфаза Деление I Профаза I. Лептонема Редукционное Метафаза I. Зигонема Анафаза I. Пахинема Телофаза I. Диплонема Цитокинез I. Диакинез Интеркинез Деление II Эквационное Метафаза II Анафаза II Телофаза II Цитокинез II В интерфазе редукционного деления в стадии S – периода происходит синтез ДНК, в результате чего хромосомы удваиваются и каждая из них представлена в виде двух сестринских хроматид.





Профаза I – происходят сложные структурные преобразования хромосомного материала, приводящие к рекомбинации генов в хромосоме.

Профаза I состоит из нескольких фаз:

Лептонема – фаза видимых нитей, хромосомы из 2-х хроматид, представленные в виде длинных, тонких нитей, собранных в клубок.

Зигонема – гомологические хромосомы отцовского и материнского организма соединяются попарно, т. е. конъюгируют, образуя биваленты, состоящие из 4-х хроматид; формируется синаптонемальный комплекс.

Пахинема – ядро, ядрышко увеличивается, биваленты утолщаются, происходит кроссинговер.

Диплонема – хромосомы, соединенные в биваленты (каждый бивалент состоит из 4 –х хроматид), начинают отталкиваться, оставаясь соединенными лишь в местах кроссинговера и образуя хиазмы (Х- образные фигуры). По фигурам бивалентов устанавливается, имел ли место и на каком участке хромосом произошел кроссинговер. На этой стадии синаптонемальный комплекс разрушается и остается лишь в местах хиазм.

Диакинез – хромосомы утолщаются, хиазмы уходят к концам хроматид, биваленты укорачиваются и утолщаются, приобретают форму и располагаются по периферии ядра. Ядерная оболочка фрагментируется, ядрышко исчезает. Ядро клетки переходит в следующую фазу – метафазу, которая идет обычным путем.

Метафаза I - биваленты выстраиваются в экватериальной плоскости цитоплазмы и прикрепляются центромерами к ахроматиновым нитям.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Анафаза I – гомологические хромосомы расходятся к полюсам без их разделения: расхождение каждой пары гомологичных хромосом носит случайный характер, т.е. происходит независимо от других пар, что и обуславливает комбинативную изменчивость и генетическое многообразие половых клеток. Каждая хромосома состоит их 2-х хроматид и к полюсам расходятся не хроматиды, а хромосомы.

Телофаза I - происходит обычным путем, завершается первое деление цитокинезом, т.е. образованием диад – двух дочерних клеток с гаплоидным набором хромосом.

Интеркинез – это очень кратковременная фаза между I и II делениями, при этом репликация ДНК не происходит т.к. каждая хромосома состоит из 2-х хроматид.

Профаза II проходит очень быстро.

Метафаза II – хромосомы на экваторе и прикрепляется центромерами к нитям веретена.

Анафаза II – центромеры делятся за счет сокращения ахроматиновых нитей и хроматиды расходятся к полюсам, при этом уменьшается количество ДНК при том же количестве хромосом.

Телофаза II – идет обычным порядком. Заканчивается II деление цитокинезом – образованием тетрад с гаплоидным числом хромосом в каждой клетке.

4. 2. Микроспорогенез, макроспорогенез. Гаметогенез Микроспорогенез – процесс образования микроспор, т.е. пыльцевого зерна, который начинается с деления материнской клетки мейозом (материнская клетка образована клетками вторичного археспория). В результате образуется тетрада микроспор. Тетрады распадаются и микроспоры переходят в пыльцевые зерна, покрытые двумя оболочками: наружней – экзиной, внутренней – интиной; имеются цитоплазма и ядро. После некоторого периода покоя одноядерной пыльцы начинает происходить гаметогенез. В результате первого деления митоза образуется 2-х ядерная пыльца, т.е. пыльцевое зерно с вегетативной и генеративной клеткой. У большинства однодольных далее наступает второе деление митозом, в результате которого генеративная клетка образует два спермия. Такая 3-х ядерная пыльца и представляет собой мужской гаметофит (рис. 11). У двудольных 2-ядерная пыльца попадает на рыльце пестика, прорастает в пыльцевую трубку, в которой происходит деление генеративной клетки митозом с образованием 2– х спермиев.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Рис. 11. Схема микроспорогенеза и микрогаметогенеза (из М.Е. Лобашева).

Мужской гаметофит представлен пыльцевой трубкой, пыльцевым зерном, двумя спермиями и вегетативной клеткой.

Макроспорогенез – это процесс образования макроспор, который протекает в семяпочке. Материнская клетка вторичного археспория делится мейозом, образует тетраду мегаспор, расположенных линейно. Три мегаспоры отмирают, а из одной в результате трех последовательных делений митоза образуется восьмиядерный зародышевый мешок со строгой полярностью: 4 ядра у микропилярного конца и 4 ядра – у халазального.

По одному ядру отходит от каждого полюса к центру. Эти 2 ядра образуют центральную клетку зародышевого мешка. Три ядра в халазальной части образуют антиподы, в микрополярном конце образуется яйцевой аппарат с яйцеклеткой и двумя синергидами (рис. 12).

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Рис. 12. Строение и развитие зародышевого мешка. (По Делоне).

Дифферинцированный восьмиядерный зародышевый мешок и представляет собой женский гаметофит.

Задание 1. Приготовить временные давленные препараты, используя ацетокарминовый метод окрашивания фиксированных корешков лука или гороха, пыльников цветков ячменя, вишни, лука.

Изучить фазы митоза, мейоза на временных препаратах, сделать рисунки в тетрадях. Описать рисунки по этапам.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 24 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.