WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     || 2 |
БИОЛОГ ИЯ БИОЛОГ ИЯ КАК СЛИВАЮТСЯ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ Ю. А. ЧИЗМАДЖЕВ Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова ВВЕДЕНИЕ Основной функцией биологических мембран является HOW ARE BIOLOGICAL MEMBRANES отделение клеток и органелл от окружающей среды.

FUSING TOGETHER Мембраны поддерживают клетку в неравновесном состоянии, обеспечивая сохранение перепадов концентраций и Yu. A. CHISMADZHEV электрического потенциала. Свободная энергия, запасенная таким образом в клетке или во внутриклеточных органелThe process of membranes fusion during exocyлах, расходуется на осуществление многих жизненно tosis is reviewed, along with the methods of важных функций – от генерации и распространения studying fusion kinetics. The mechanism of нервного импульса до химического синтеза и совершения механической работы. Разрушение плазматичесlipid bilayer fusion is described. A model of кой мембраны несет клетке немедленную смерть. В то protein-lipid fusion during exocytosis is preже время в любой живой клетке постоянно происходят sented.

трансформации мембран, сопровождающиеся локальным и кратковременным нарушением их целостности Описаны процесс слияния мембран в ходе эки последующим замыканием с образованием новых зоцитоза, а также методы изучения его ки- структур. Эти процессы, называемые слиянием и делением мембран, происходят при каждом акте экзо- и нетики. Рассмотрен механизм слияния лиэндоцитоза, при делении клеток и митохондрий, оплопидных бислоев. Представлена модель лидотворении, образовании многоядерных клеток при пид-белкового комплекса, ответственного дифференцировке, при инфицировании оболочечныза образование и развитие пары слияния.

ми вирусами. Искусственно вызванное слияние мембранных образований широко используют при решении различных биотехнологических и биомедицинских задач. Хотя слияние и деление – это родственные процессы, сегодня известно гораздо больше именно о слиянии, которому и посвящен наш рассказ. Важно отметить, что, несмотря на многообразие явлений слияния, между ними есть немало общего. Это позволяет думать, что в их основе лежат единые физические принципы.

СЛИЯНИЕ МЕМБРАН ПРИ ЭКЗОЦИТОЗЕ Рассмотрим процесс экзоцитоза на примере тучных клеток, секретирующих гистамин, гепарин и серотонин.

Эти клетки и находящиеся в них гранулы настолько велики, что с помощью электронной микроскопии удается наблюдать весь ход экзоцитоза, который проиллюстрирован схематически на рис. 1, а. В исходном состоянии мы имеем клетку и секреторную гранулу (состояние 1), удаленную от плазматической мембраны. В www.issep.rssi.ru ответ на определенный стимул гранула приходит в тесный контакт с плазматической мембраной (состояние 2).

СОРОСОВСКИЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЖУРНАЛ, ТОМ 7, №5, Чизмаджев Ю.А., © БИОЛОГ ИЯ аб Клетка Внеклеточная Внеклеточная Внеклеточная Гранула среда среда среда Белки слияния Г Г Гранула ранула ранула 20 нм Пора слияния Рис. 1. Схематическая иллюстрация процесса экзоцитоза: а – показаны секреторная гранула (1), клетка, пора слияния и белки слияния; б – электронная микрофотография поры слияния. Стрелками показана пора слияния. На микрофотографии видно, что мембраны в этом месте стянуты друг к другу и формируют так называемый димпл На микрофотографии (рис. 1, б) видно, что в зоне кон- ране до тех пор, пока не образуется плотный контакт, такта плазматическая мембрана выгибается в сторону обеспечивающий электрическую и химическую изолягранулярной, образуя так называемый димпл, вершина цию внутренности пипетки от окружающего раствора.

которого представляет собой сильно искривленную Кусочек мембраны, который находится на кончике пимембрану. В этой области, порядка 10 нм, липидные петки, деликатно разрушается, в результате чего вознидомены гранулярной и плазматической мембран нахо- кает электрический и химический доступ внутрь клетки дятся в близком контакте. Предполагается, что именно (рис. 2, а). Усилитель тока, включенный между двумя здесь происходят слияние мембран и образование поры электродами, один из которых находится в пипетке, а слияния (состояние 3), которая обеспечивает возмождругой – в окружающем клетку растворе, позволяет ность выхода содержимого гранулы в окружающую среподдерживать определенный мембранный потенциал ду. Таким образом, слияние подразумевает объединение и измерять электрический ток, состоящий из омичесмембран и установление связи через пору слияния кой и емкостной компонент. Последняя отвечает перемежду внутригранулярным пространством и внекленосу ионов, которые необходимы для заряжения мембточной средой. На электронных микрофотографиях ранной емкости до определенного потенциала. Полный удается увидеть только достаточно крупные поры, около перенесенный заряд пропорционален площади мемб50 нм в диаметре (рис. 1, б). Стенки этих пор образованы ранного конденсатора. Следовательно, если с плазмасильно изогнутыми липидными бислоями. В окрестнотической мембраной сливается гранула, находящаяся в сти поры слияния видны белковые макромолекулярные цитоплазме, и тем самым увеличивается суммарная структуры, в том числе нитевидные образования, постплощадь клеточной поверхности, это может быть обнароенные из актина. Предполагается, что именно они ружено методом пэтч-клампа путем регистрации емкоспособствуют образованию димплов.

стного тока. Зарядка мембранного конденсатора гранулы происходит через пору слияния, проводимость К сожалению, с помощью электронной микроскокоторой определяет кинетику емкостного тока. Региспии не удается зарегистрировать малую пору, чтобы трируя этот ток как функцию времени, можно устаноразобраться в механизме ее образования в ходе перезавить, как именно изменяется радиус поры. Измерения мыкания исходных мембран. Принципиально новые возможности открылись после того, как был разрабо- показали, что пора открывается скачком, ее радиус при этом составляет 0,2 нм, затем она закрывается, оттан метод пэтч-клампа (отведение тока при помощи микропипетки), который произвел буквально револю- крывается вновь и, наконец, размер поры начинает быцию в клеточной биологии [1]. Метод пэтч-клампа стро нарастать. Измерения емкости гранулы на стадии удивительно красив и прост. Крошечная стеклянная быстрых переходов между открытым и закрытым сомикропипетка прижимается к плазматической мемб- стояниями поры показали, что площадь гранулы за это ЧИЗМАДЖЕВ Ю.А. КАК СЛИВАЮТСЯ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ БИОЛОГ ИЯ близкое расстояние, чтобы они самопроизвольно слиа Усилитель лись Ответить на него удалось с помощью бислойных тока липидных мембран (БЛМ).



СЛИЯНИЕ ПЛОСКИХ БЛМ Электрод Общая картина процесса. Плоские БЛМ являются очень удобной и эффективной моделью, которая помогла решить множество задач биофизики мембран (см. [2] и [3]). Плоская БЛМ обычно формируется в ячейке, соГранула стоящей из двух камер, разделенных тонкой тефлоновой Микропипетка перегородкой, в которой имеется маленькое отверстие диаметром порядка 1 мм. Ячейку заполняют раствором Клетка Белки электролита, в камеры вводят электроды и на перегослияния родку в области отверстия наносят каплю раствора фоПора сфолипидов в органическом растворителе, например в слияния н-декане. Капля самопроизвольно растекается, при этом избыток липида и растворителя вытесняется на б периферию отверстия, формируя так называемый мениск, а в центре отверстия возникает липидный бислой толщиной около 4 нм. Естественно было применить эту модель для изучения слияния мембран, создав вместо одного бислоя два расположенных соосно. Это бы1 2 3 ло реализовано с помощью трехкамерной ячейки, изо4 браженной на рис. 2, б.

M1 MМембраны М1 и М2 формируются на отверстиях в перегородках, стержни 4 и 5 позволяют повышать давI II III ление в отсеках I и III и тем самым выдавливать бислои навстречу друг другу. Во всех отсеках находятся электроды, подключенные к измерительной аппаратуре, которая позволяет регистрировать омический и емкостРис. 2. Методы изучения слияния БЛМ: а – пэтчкламп; б – конструкция трехкамерной измеритель- ный токи, а также измерять плотность поверхностного ной ячейки для изучения слияния БЛМ. 1, 2, 3 – заряда любого монослоя до и после слияния. Площадь электроды; 4, 5 – стержни бислоев определяется визуально с помощью микроскопа. Эта методика требует от исследователя незаурядновремя заметно возрастает. Этот рост достигается за счет го мастерства, но зато позволяет наблюдать и изучать переноса 105 липидных молекул из плазматической всю последовательность стадий процесса слияния. Посмембраны в мембрану гранулы. Из этого наблюдения ле приведения в контакт двух бислоев удается выявить следует, что стенки самых малых пор выстланы липиодни и те же характерные стадии процесса слияния дами, что обеспечивает связность системы по липид(рис. 3, А). Выдавливание мембран навстречу друг друной компоненте и значительный липидный поток, гу из исходного положения (состояние 1) с помощью движущей силой которого является, по-видимому, разперепада гидростатического давления приводит к поность натяжений между плазматической мембраной и степенному уменьшению толщины водной прослойки мембраной гранулы. Эти результаты служат дополнимежду ними вплоть до установления равновесного плостельным аргументом в пользу предположения, что сликопараллельного контакта (состояние 2). При этом гияние мембран происходит в области вершины димпла, дростатическое давление и молекулярное притяжение, стенки образующейся поры слияния включают в свой сближающие бислои, уравниваются с действующими в состав липиды и, возможно, какие-то белки, причастпротивоположном направлении силами гидратационные к процессу слияния.

ного и электрического отталкивания. Пока все выглядит Таким образом, мы пришли к выводу, что форми- просто и понятно, а дальше начинаются удивительные рование тесного локального контакта мембран – это вещи. Оказывается, состояние 2 является метастабильфункция белка. Теперь попробуем ответить на следую- ным, то есть спустя некоторое время происходит самощий вопрос: достаточно ли свести липидные бислои на произвольный переход из 2 в 3. В ходе этой стадии два СОРОСОВСКИЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЖУРНАЛ, ТОМ 7, №5, БИОЛОГ ИЯ ма интеркаляции необходимо приложить к исходным А 1 2 3 бислоям фантастическое давление, которое эквивалентно создаваемому водяным столбом в 100 км высотой.

p Это связано с тем, что требуются громадные усилия, чтобы перенести полярные головки фосфолипидов через гидрофобный слой мембраны. Оценка оценкой, но хотелось бы подтвердить ее прямыми экспериментами.

Б Это было сделано следующим образом. Исходные бисПолярные лои формировали из разных фосфолипидов – один из головки нейтральных, а другой из заряженных. Затем их слили, Гидрофобное получили контактный бислой и измерили плотность ядро поверхностного заряда на его монослоях. Предсказание совершенно очевидно: если работает механизм в а б г встраивания, то оба монослоя контактной мембраны должны стать равно заряженными с половинной от Рис. 3. А – последовательность промежуточных со- исходной плотностью заряда (рис. 4, а). Результат стояний, которая наблюдается при слиянии двух оказался совершенно другим: один монослой остался плоских липидных бислоев; Б – схема возникновения и развития сталка. Объяснения в тексте бислоя, находившиеся в тесном контакте, превращаются в один бислой, обеспечивающий непрерывность внешних монослоев мембран в пределах всей системы.





Можно сказать, что здесь произошло полуслияние:

мембраны объединились, но водные объемы камер I и III по-прежнему разъединены. Термин “полуслияние” отражает и то обстоятельство, что слились только внешние монослои мембран. Чтобы убедиться в этом, достаточно пометить липиды во внешнем монослое одной мембраны, включив в нее например, какое-то количество заряженных липидов, тогда как другая мембрана таковых не содержит. Измерения поверхностного потенциала показали, что после завершения полуслияния заряженные липиды обнаруживаются во внешнем монослое второй мембраны.

Состояние 3 является довольно устойчивым. Разрушить контактный бислой и тем самым завершить процесс слияния (состояние 4) можно прикладывая к контактному бислою электрическое поле. В результате возрастает вероятность появления в нем поры, развитие которой приводит к разрушению бислоя (подробно описано в [3], [4]). Эта стадия фактически завершает процесс слияния, так как теперь объединены и мембраны, и водные объемы отсеков I и III.

Механизм полуслияния. Перейдем к рассмотрению самой интригующей стадии процесса – полуслиянию (рис. 3, Б) [5]. Можно представить несколько механизмов превращений двух соприкасающихся бислоев в аб один. Например, пусть липидные молекулы одного бислоя расступаются, и между ними внедряются липиды Рис. 4. Иллюстрация двух возможных путей полуиз второго бислоя (рис. 4, а). Энергетические расчеты, слияния: а – интеркаляция, б – выдавливание монооднако, показывают, что для реализации этого механиз- слоев ЧИЗМАДЖЕВ Ю.А. КАК СЛИВАЮТСЯ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ БИОЛОГ ИЯ нейтральным, а другой сохранил прежний заряд. От- рофобные «хвосты» липидных молекул (б). Притяжение сюда следует очевидный вывод – контактный бислой таких гидрофобных пятачков на соседних мембранах формируется из удаленных монослоев исходных мемб- приводит к формированию между ними перемычки (в), ран, а близлежащие монослои отступают из области которую назвали сталком (от англ. stalk – стебелек).

контакта (рис. 4, б). Визуальные наблюдения показы- Сталк обладает высокой энергией, так как формируювают, что полуслияние начинается из одной точки. Это щий его липидный бислой сильно изогнут. Расширеподтверждается также измерениями емкости системы в ние сталка, сопровождающееся слиянием удаленных реальном времени. В состоянии плоскопараллельного монослоев, приводит к образованию контактного бисконтакта емкость относительно мала, так как она опре- лоя. Однако, чтобы сталк спонтанно расширялся, его деляется двумя последовательно включенными кон- энергия должна убывать по мере расширения. Расчет денсаторами, каждый из которых эквивалентен одному энергии сталка показал, что она зависит от природы бислою. В течение некоторого времени ожидания ем- липидов и их склонности к изгибным деформациям.

кость остается постоянной, после чего она начинает Молекулярная геометрия липидов. В мембранолорасти и выходит на значение, равное емкости бислоя.

гии распространено понятие “молекулярная форма лиОпыты показали, что времена ожидания полуслияния пида”, отражающее соотношение размеров полярной имеют порядок от секунд до минут и в существенной головки и гидрофобной части молекулы в плане. Подстепени зависят от липидного состава мембран. Рост черкнем, что под формой липидных молекул подразуемкости во времени, очевидно, отражает динамику росмевается не просто конформация отдельной молекулы, та зародыша контактного бислоя. Теперь обсудим, как а эффективная форма липида в построенном из него представляется сегодня этот зародыш, какова его монослое, которая в значительной степени отражает структура, как он возникает и развивается.

взаимодействие молекул между собой и с окружающим Модель сталков. Прежде всего заметим, что полу- раствором. Так, молекула лизолипида (например, LPC), у слияние энергетически выгодно, так как переход из со- которой голова шире хвоста, – это конус, фосфатидилстояния 2 в 3 (рис. 3, А) уменьшает суммарную поверх- холин (PC) – цилиндр, а фосфатидилэтаноламин (РЕ), ность системы: вместо двух бислоев мы получаем один.

у которого голова уже хвоста, – обратный конус (рис. 5).

Однако состояния 2 и 3 отделены активационным ба- При переходе от отдельных молекул к описанию монорьером, который определяет время ожидания моно- слоя в целом принято характеризовать его так называеслойного слияния. Преодолеть этот барьер помогают мой спонтанной кривизной. Она определяется как та тепловые флуктуации. Высота барьера во многом опре- кривизна, которую приобрел бы свободный монослой.

деляется свойствами промежуточных состояний, через Спонтанная кривизна монослоя отличается, конечно, которые осуществляется переход 2 3. Их выбор от реальной геометрической кривизны, которая обусдиктуется тем, какие деформации претерпевает бислой ловлена не формой входящих в него молекул, а совов ходе тепловых флуктуаций.

купностью действующих на него внешних сил и моНапомним, что липидный бислой – жидкий крис- ментов. Итак, монослой, содержащий LPC, стремится талл. Латеральная (вдоль бислоя) подвижность липид- стать выпуклым, а содержащий РЕ – вогнутым. Приных молекул велика, в этом направлении мембрана те- нято считать, что в первом случае монослой обладает положительной спонтанной кривизной, а во втором – чет как обычная жидкость. В перпендикулярном к отрицательной. На рис. 5 проиллюстрирована тенденповерхности направлении липидный бислой гораздо ция липидных молекул в зависимости от их формы обближе к твердому телу, он с трудом поддается сжатию.

Pages:     || 2 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.