WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 |

После того как был клонирован GFP из A.victoria, возникла необходимость обогатить палитру применяемых цветных маркеров, чтобы в одном опыте метить флуоресцентными метками сразу несколько генов. Поиск разноцветных флуоресцентных белков увенчался успехом. Несколько десятков таких белков были найдены коллективом российских исследователей, но уже не в биолюминесцентных организмах, а в разных видах несветящихся кораллов. Большинство этих белков ответственно за цветную (синеватую или зеленую, желтую, оранжевую, красную) флуоресценцию всего животного или отдельных участков тела. Другие – за пурпурную или голубую окраску.

Применение многоцветных меток особенно перспективно в так называемом методе индуктивно-резонансного переноса энергии. Этот метод позволяет наблюдать взаимодействия между белками. Чтобы увидеть контакты между белковыми молекулами, один их тип метят сравнительно коротковолновой флуоресцентной меткой, например, зеленой (максимум излучения на 508 нм), а другой - длинноволновой, скажем, с красной флуоресценцией (излучением 583 нм), возбуждаемой зеленым светом. Если облучить объект ультрафиолетовым или синим светом, флуоресценция будет зеленой только до тех пор, пока первый из меченых белков не соединится со вторым. Когда эти белки вступят в контакт, флуоресценция станет красной из-за миграции энергии с первой метки на вторую. Так можно изучать взаимодействия антитела с антигеном, вирусного белка и связываемого им белка “хозяина”, молекулярного рецептора с белковым гормоном и т.д.

Можно наблюдать разрушение белка ферментами протеазами.

Биолюминесценция моря Свечение моря представляет собой величественное зрелище. Световой сигнал даже самого яркого живого излучателя угасает и становится неразличим на расстоянии нескольких десятков метров. Но если одновременно вспыхивают по какой-либо общей причине или возбуждая друг друга миллиарды живых существ, мощность их излучения за секунду составляет сотни киловатт. Их свет заливает многие километры морской поверхности и виден, как утверждают космонавты, даже из космоса.

Свет в море возникает только в живых организмах. Никакого другого света, кроме как излучаемого биолюминесцентными организмами, в море нет.

Морские светящиеся бактерии – самые мелкие организмы моря, излучающие свет.

Среди биолюминесцентных организмов моря только бактерии излучают свет непрерывно.

Развиваясь на органических остатках, образующих в море хлопья так называемого планктонного снега, они могут вносить заметный вклад в свечение моря. Большинство светящихся морских бактерий являются факультативными симбионтами и используют свет как приманку, обеспечивающую попадание в кишечник рыб, где они находят для себя оптимальную среду обитания.

Динофлагелляты, или жгутиконосцы, более других ответственны за формирование биолюминесцентного поля больших пространств океана в удаленной от берегов части.

Излучают динофлагелляты импульсами. Возбужденная клетка через несколько миллисекунд после воздействия раздражителя вспыхивает на 100-300 мс и снова угасает.

В открытом океане господствующей биолюминесцентной формой являются перидинеи (род Pyrocystis), у которых обнаруживается четкий ритм биолюминесценции. Виды этого рода вносят большой, иногда основной, вклад в свечение верхней стометровой толщи вод в тропических и экваториальных широтах океана.

Радиолярии, как и большинство светящихся организмов, генерирует световую вспышку в ответ на механическую стимуляцию. Вклад радиолярий в общую картину свечения невелик. Они обитают повсеместно, но главным образом в глубинных водах.

Люминесценция среди кишечнополостных распространена довольно широко.

Известно несколько десятков видов гидромедуз, излучающих свет. В группе сцифомедуз достоверно известны четыре светящихся рода. Наиболее распространена в океане медуза Pelagia noctuluca, диаметр колокола которой достигает 25 см, а протяженность щупалец – 2 м. При ее раздражении вспыхивают зеленым светом полосы на поверхности колокола и щупалец.

Ктенофоры, или гребневики, обладают способностью к яркому излучению.

Характерная особенность светящихся гребневиков состоит в том, что они угасают при внешнем освещении, даже при лунном свете.

У моллюсков встречается биолюминесценция всех известных типов – внутриклеточная, внеклеточная и симбиотическая бактериальная. Наиболее интересны светящиеся головоногие моллюски (кальмары, осьминоги), представляющие собой широко распространенную, богатую видами и очень разнообразную группу организмов.

Благодаря широте обитания, обилию видов и массовости головоногие, по-видимому, в ряде случаев могут создавать значительные по интенсивности биолюминесцентные поля.

Светящимся видам морских ракообразных наряду с простейшими принадлежит ведущее место в формировании биолюминесцентного поля океана. Особенно замечательны в этом отношении виды рода Cypridina. Примечательно свойство рачков отвечать светом на вспышку другой особи. Механическое возбуждение вызывает такую же вспышку в виде облачка голубоватого света, объем которого в несколько раз больше размера породившего его рачка.

Свечение широко распространено среди рыб, особенно обитателей больших глубин, куда не проникает свет солнца. Около 98 % всех глубоководных рыб имеют фотофоры того или иного типа.

Применение биолюминесцентных методов Биолюминесценция нашла широкое применение в виде аналитических методов для решения проблем охраны окружающей среды, проведения научных исследований, в медицине и т.п. Этому способствовало, в частности, то обстоятельство, что современные методы регистрации излучения хорошо разработаны и достигли высокой чувствительности.



В биолюминесцентном анализе используются как живые светящиеся организмы (главным образом бактерии), так и выделенные из них фермент-субстратные системы.

Назовем несколько типов биолюминесцентного анализа:

1. Применение светящихся бактерий.

Чрезвычайно удобно использовать светящиеся бактерии для определения концентрации молекулярного кислорода. В результате собственного дыхания бактерии в закрытой кювете постепенно угасают, а добавление кислорода в концентрациях от 10-моль до 510-6 моль вызывает световые вспышки, интенсивность которых пропорциональна количеству добавленного молекулярного кислорода. Концентрация кислорода – это один из показателей качества воды природных и искусственных водоемов, поэтому биолюминесцентные бактерии могут быть использованы для контроля загрязнения окружающей среды.

Используются также мутантные формы бактерий – такие, которые не светятся, потому что им не хватает определенного вещества. На добавление этого вещества (например, альдегида или миристиновой кислоты) бактерии реагируют вспышкой света.

При достаточной быстроте этого метода (время анализа – 1 мин), он отличается высокой чувствительностью (10-9 моль для альдегидов и 10-10 моль для миристиновой кислоты).

2. Применение выделенных биолюминесцентных систем.

Ферментативные биолюминесцентные реакции, выделенные из светящихся организмов, активно применяются для анализа концентраций субстратов этих реакций.

Благодаря высокой специфичности люцифераз по отношению к своим субстратам достигается чрезвычайно высокая чувствительность биолюминесцентных методов: с помощью бактериальной люциферазы возможно определить содержание в пробе алифатических альдегидов концентрации 10-14 моль.

Биолюминесцентная реакция, выделенная из светляков, замечательна тем, что в ней участвует один из важнейших в природе метаболитов – АТФ. При этом интенсивность биолюминесценции пропорциональна концентрации АТФ в широком диапазоне. На этом основан один из самых чувствительных методов анализа ATФ в различных объектах.

Удается определять ATФ в образце от 10-17 моля и выше. Поскольку биосинтез ATФ – показатель нормальной жизнедеятельности клеток, препарат, включающий люциферин и люциферазу светляка используют для обнаружения бактериального заражения в какойлибо среде, оценки жизнеспособности эритроцитов при консервировании крови, изучения действия на микроорганизм антибиотиков, в клинической биохимии, промышленной и медицинской микробиологии, мониторинге окружающей среды.

Фотопротеины кишечнополостных активно применяются в качестве индикатора ионов кальция в клетке. Эти ионы присутствуют в самых разных клетках, а повышением их концентрации в цитоплазме запускается множество клеточных процессов: мышечные и немышечные сокращения, передача нервных импульсов, клеточные деления и многие другие. Так что с помощью биолюминесцентных систем гидроидов можно следить за всеми перечисленными событиями в клетке «со стороны», не вмешиваясь.

Круг анализируемых с помощью биолюминесцентных методов веществ может быть расширен построением цепи сопряжения других ферментов с люциферазами. Если какойто другой фермент катализирует реакцию, в которой происходит образование субстрата для люцифразы, то это дает возможность анализировать концентрацию этого второго фермента, его субстратов.

Начато активное применение люцифераз и фотопротеинов в иммуноферментном анализе.

Тема 5. Фотодинамическое действие света. Влияние УФ-излучения на живые организмы (действие на белки, нуклеиновые кислоты, мембраны). Эффекты фоторепарации и фотозащиты. Фотобиологические реакции в коже. Эритема.

Пигментация кожи (загар), канцерогенез. Фотосенсибилизация: механизмы и применение.

Основы фотодинамической терапии.

Согласно основному закону фотохимии и фотобиологии, на организм оказывает действие только то излучение, которое поглощается молекулярными структурами в составе этого организма. Биологические молекулы имеют характерные спектры поглощения, т.е. они поглощают не любой свет, а только с определенной длиной волны.

Это связано с химическим строением веществ. Например, молекула ДНК поглощает излучение с длиной волны 200-315 нм, поэтому если освещать ее светом с длиной волны, скажем, 400 нм, то никакого воздействия этот свет на нее не окажет.

Биологически активен весь диапазон оптического излучения (200-750 нм), но наиболее острые эффекты вызывает ультрафиолетовый свет (200-400 нм). Малые дозы УФ-излучения используются в физиотерапии, поскольку способствуют биосинтезу витамина D, оказывают бактерицидное и стимулирующее действие. В больших дозах ультрафиолет вызывает покраснение кожи (эритему) и может вызвать ожоги (эдему) и развитие раковых опухолей (канцерогенез). В фотомедицине принято разделять ультрафиолетовый диапазон на три спектральные области: УФ-А (320 – 400 нм), УФ-В (280 – 320 нм) и УФ-С (длины волн короче 280 нм).

В живых клетках, не содержащих хлорофилл, УФ-излучение поглощается в основном нуклеиновыми кислотами и белками, в меньшей степени коферментами и пигментами. Поглощение света нуклеиновыми кислотами лежит в основе мутагенного и бактерицидного действия ультрафиолета. В то же время слабоделящиеся клетки повреждаются этим излучением главным образом из-за денатурации белков и повреждения мембран.

Инактивация белков ультрафиолетовым излучением Белки выполняют в организмах очень много разных функций. Они служат в клетках строительным материалом и транспортом, катализируют биохимические реакции и т.д.





Конечным результатом действия ультрафиолетового излучения на белки является их инактивация, т.е. потеря ферментативной, регуляторной, гормональной, транспортной и иммунологической активностей.

Как известно, белки представляют собой полипептидные цепи, т.е. состоят из аминокислотных остатков (пептидов), которых имеется 20 видов. УФ-излучение оптического диапазона поглощается только некоторыми из этих остатков:

ароматическими (тирозин, триптофан, фенилаланин), гистидином и серосодержащими (цистин, цистеин и метионин). После поглощения кванта света данные аминокислоты могут перейти в возбужденное состояние и вступить в фотохимическую реакцию. Два типа реакций имеют первостепенное значение: (1) фотоионизация тирозина и триптофана (они отдают электрон молекулам окружающей их воды, сами превращаясь при этом в радикалы) и (2) фотодиссоциация дисульфидной связи (-SS-) цистина. Затем продукты этих фотохимических реакций реагируют с окружающими аминокислотами, что приводит к возникновению внутри- и межмолекулярных связей между полипептидными цепями. Это приводит к снижению растворимости белка. А если белок выполняет функцию фермента – то он перестает катализировать реакции. В молекуле фермента обычно имеется несколько ароматических аминокислот, дисульфидных связей (-SS-) и сульфгидрильных групп (-SH), но разрушение только некоторых из них (а не любой) приводит к инактивации белка.

Действие ультрафиолета на нуклеиновые кислоты Нуклеиновые кислоты ДНК и РНК состоят из нуклеотидов. Основными поглощающими ультрафиолет структурами этих кислот являются пуриновые (аденин и гуанин) и пиримидиновые (цитозин, тимин и урацил) азотистые основания нуклеотидов.

Пиримидиновые основания разрушаются гораздо легче пуриновых, поэтому нуклеиновые кислоты повреждаются под действием ультрафиолета в основном через фотохимические реакции цитозина, тимина или урацила. Например, при поглощении кванта света может происходить разрыв двойной связи в тимине с образованием двух свободных валентностей. Если вблизи от этого места то же самое происходит и в соседней спирали, то они могут замкнуться. Такая сшивка ведёт к потере генетического кода клетки, задержке роста и деления и, в конце концов, к её гибели.

Вообще, к настоящему времени выявлено несколько типов фотохимических реакций, ведущих к различным повреждениям нуклеиновых кислот: образование димеров тимина, урацила, цитозина, цитозин-тимина, тимин-урацила; гидратация (присоединение молекул воды) цитозина и урацила; внутри- и межмолекулярные сшивки молекул ДНК; сшивки ДНК-белок; разрывы сахаро-фосфатного остова нуклеиновых кислот.

Действие ультрафиолета на липиды Помимо ДНК и белков ультрафиолет может действовать и на липиды – то есть на мембраны клеток. При облучении изменяется их ионная проницаемость, из-за чего клетки набухают и разрываются. В частности, кванты света разрушают эритроциты и работу внутриклеточных органов, таких как митохондрии и лизосомы.

В состав липидов входят полиненасыщенные (т.е. имеющие много двойных С=Ссвязей) жирные кислоты, что и делает их чувствительными к фотоокислению. Максимум поглощения ненасыщенных жирных кислот располагается в области 200 нм. Под действием ультрафиолета в мембране начинается цепная реакция, в результате которой получаются гидроперекиси. Это приводит к разрушению структуры мембраны. Кроме того, продукты цепных реакций липидов очень токсичны и взаимодействуют с близлежащими белками и другими биологически важными молекулами. Например, таким образом происходит окисление витаминов А и D. Возможна также и обратная ситуация:

квант света поглощается белком, который в возбужденном состоянии начинает цепную реакцию окисления липидов.

Эффекты фоторепарации и фотозащиты Репарация – это свойственный клеткам всех организмов механизм исправления повреждений в молекуле ДНК, возникающих в ходе ее биосинтеза или под влиянием внешних химических или физических факторов (в том числе ультрафиолетового излучения).

Выделяют три основных механизма удаления повреждений в ДНК, каждый из которых реализуется с участием своего набора ферментов:

1. Эксцизионная репарация.

Специфическая нуклеаза удаляет небольшой сегмент ДНК, включающий поврежденный участок. Удаленный участок восстанавливается ДНК-полимеразой, использующей в качестве матрицы комплементарную цепь. Наконец, оставшийся одноцепочечный разрыв закрывается ДНК-лигазой.

2. Фотореактивация,удаляющая тиминовые димеры.

Специфическая фотолиаза связывается с дефектным участком ДНК и после облучения расщепляет димер с образованием отдельных нуклеиновых оснований.

3. Репарация в результате рекомбинации.

В этом процессе участок, содержащий повреждение, пропускается во время репликации.

Образующаяся брешь закрывается путем сдвига соответствующего сегмента из правильно реплицированной второй цепи. Новая брешь ликвидируется с участием полимераз и ДНКлигаз. В завершение первоначальный дефект устраняется путем вырезания.

В клетках предусмотрена также защита от фотоповреждений (или фотозащита).

Например, участвует в фотозащите гормон серотонин, который встраивается в ДНК (без образования химических связей) и мешает образованию опасных димеров. Цепное фотоокисление липидов клетка может затормозить с помощью ингибиторов – молекул, перехватывающих свободные радикалы. Ингибиторы цепного окисления называются антиокислителями, или антиоксидантами. Наиболее известный из них – -токоферол (витамин Е).

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.