WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     || 2 |
ХИМИЯ ХИМИЯ ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АВТОМАТИЧЕСКИХ СИНТЕЗАТОРОВ Л. М. ХАЛИМСКАЯ Новосибирский государственный университет ВВЕДЕНИЕ Белки и нуклеиновые кислоты – два важнейших класса THE CHEMICAL SYNTHESIS биологически активных веществ, входящих в состав OF PROTEINS AND NUCLEIC ACIDS живых клеток. Биологические функции белков чрезUSING AUTOMATIC SYNTHESIZERS вычайно разнообразны. Все биохимические реакции катализируются белками-ферментами. Многие гормоL. M. KHALIMSKAYA ны, токсины, некоторые антибиотики являются белками или их более короткими фрагментами – пептидами.

The modern solid phase method of chemical Существуют белки, осуществляющие транспорт различsynthesis of protein and nucleic acid fragments ных молекул и ионов через клеточные мембраны или с is described. General schemes of the formation током крови. Важную роль играют защитные белки, которые помогают организму бороться с болезнями, of these biopolymers, which are used on autoструктурные белки, составляющие основу многих ткаmatic synthesizers, are presented.

ней, двигательные белки, белки-рецепторы, регуляторные белки и пептиды, а также пищевые белки. БиологиОписан современный твердофазный метод ческая функция нуклеиновых кислот заключается в химического синтеза фрагментов белков и хранении и передаче генетической информации в жинуклеиновых кислот. Приведены принципи- вых клетках.

За последние 40 лет в области химического синтеза альные схемы получения этих биополимеэтих биополимеров достигнуты значительные успехи.

ров, используемые в автоматических синСинтезировано множество пептидов, которые испольтезаторах.

зуют в медицине и сельском хозяйстве. Химическим путем удается получать улучшенные аналоги природных пептидов с более избирательным, усиленным или длительным действием. Осуществлен также синтез некоторых небольших белков, например гормона инсулина и некоторых ферментов.

В настоящее время достаточно быстро можно синтезировать искусственные фрагменты нуклеиновых кислот разной длины и любого состава (такие фрагменты называются олигонуклеотидами), а затем соединить их в более длинные цепи с помощью специальных ферментов. Полученные таким образом гены и их фрагменты широко используются в генетической инженерии, биотехнологии, а также для диагностики инфекционных и генетических заболеваний. Большие надежды связаны с их применением для направленного воздействия на генетический аппарат клетки (генотерапия). С www.issep.rssi.ru помощью синтетических фрагментов ДНК можно модифицировать природные гены, вводя в них определенные ХАЛИМСКАЯ Л.М. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Халимская Л.М., © ХИМИЯ изменения. Таким способом можно вводить направ- Существует также одна иминокислота – пролин:

ленные модификации в структуру белка, кодируемого данным геном (белковая инженерия). Это открыло путь HN CHCOOH к созданию белков, обладающих измененной биологиH2C CHческой активностью, например к получению ферменCHтов с улучшенными свойствами. Указанные пути улучшения старых и создания новых белков открывают Аминокислоты в белках соединены между собой широкие перспективы для медицины и биотехнологии.

пептидными связями:

СТРОЕНИЕ БЕЛКОВ … … И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ NH2CHCO NHCHCO NHCHCO NHCHCOOH Белки и нуклеиновые кислоты являются биополимера- R1 R2 Ri Rn ми, состоящими из мономерных остатков – аминокисПептидная связь лот (белки) или нуклеотидов (нуклеиновые кислоты).

В состав белков и пептидов входят 20 канонических В состав нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов аминокислот, которые отличаются между собой струквходят пять нуклеотидов, отличающихся между собой турой радикала R:

строением азотистого гетероцикла В. Три из них – проNH2CHCOOH изводные аденина (А), гуанина (G) и цитозина (С) вхоR дят в состав и ДНК и РНК, производное тимина (Т) – Аминокислота R только в ДНК, урацила (U) – только в РНК. Нуклеотиды в отличие от нуклеозидов содержат остаток фосфорГлицин –Н Аланин ной кислоты:

–CHВалин –CH(CH3)OH Лейцин –CH2CH(CH3)Изолейцин O P OH –CH(CH3)(C2H5) B B O O HO O Фенилаланин CHТирозин CH2 OH O X O X H Нуклеозид Нуклеотид Триптофан CHЕсли Х = ОН – это рибонуклеозид и рибонуклеотид, входящие в состав РНК. При Х = Н – это дезоксиN рибонуклеозид и дезоксирибонуклеотид, они входят в Серин –CH2OH состав ДНК. Структура азотистых гетероциклов нуклеТреонин –CH(OH)CHиновых кислот:

Аспарагиновая кислота –CH2COOH Глутаминовая кислота –(CH2)2COOH NH2 O NHАспарагин –CH2CONHN N Глутамин –CH2CH2CONHN NH N Лизин –(CH2)4NHN N NH2 O N N N Аргинин (CH2)3NH C NHNH B = (A) (G) (C) O O Гистидин CHCHHN HN HN N O O N N Метионин –(CH2)2SCHЦистеин –CH2SH (U) (T) СОРОСОВСКИЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЖУРНАЛ, ТОМ 6, №10, ХИМИЯ В нуклеиновых кислотах нуклеотиды соединены Образующийся димер реагирует далее со следуюмежду собой фосфодиэфирными связями: щим мономером (аминокислотой или нуклеотидом) с образованием тримера и т.д. Для проведения этих реакOH ций необходимо выполнение следующих условий.

BO O P O 1. Нужно добиться селективности соединения мономерных звеньев. Например, карбоксильная группа OH первой аминокислоты должна прореагировать с аминоO X группой второй аминокислоты, тогда как другие амиBO но- и карбоксильная группы не должны участвовать в O P O реакции. То же и в случае конденсации нуклеотидов – OH гидроксильная группа первого нуклеотида должна взаO X имодействовать с фосфатным остатком второго, но не Bi наоборот. Для этого фрагменты, которые не участвуют … O O P O в реакции, нужно блокировать с помощью специальOH ных защитных групп.

2. Сами по себе карбоксильная и аминогруппы в O X аминокислотах (так же, как и фосфатная и гидроксильBn … O O P O ная группы в нуклеотидах) не реагируют друг с другом.



OH Для проведения конденсации мономеров нужно активировать карбоксильную (фосфатную) группу.

HO X 3. Поскольку синтез проводится в несколько стаСтроение нуклеиновых кислот, а также основные дий, каждая реакция должна проходить с очень высодостижения их химии и биохимии описаны в статьях ким выходом. В противном случае общий выход будет Д.Г. Кнорре [1, 2].

катастрофически падать с ростом длины целевого проЗадачей химического синтеза белков и нуклеинодукта. Например, для получения фрагмента длиной девых кислот является соединение входящих в их состав сять звеньев нужно провести девять реакций конденсамономеров в строго определенной последовательносции. При 90%-ном выходе на каждой стадии общий ти. Схематически образование пептидной связи можно выход продукта составит 0,99 100 = 39%. Для синтеза представить как конденсацию двух аминокислот с отфрагмента длиной 20 звеньев понадобится провести щеплением молекулы воды:

19 реакций конденсации, и общий выход продукта составит всего 0,919 100 = 13,5%. Чтобы добиться получе+ NH2CHCOOH HNHCHCOOH ния значительного количества вещества при синтезе - H2O протяженных фрагментов белков и нуклеиновых кисR1 Rлот, выход на каждой стадии должен составлять 96–98%.

NH2CHCO NHCHCOOH 4. Все процессы – введение и удаление защитных групп, активация и конденсация – должны проводитьR1 Rся в мягких условиях, то есть без использования высоДля образования межнуклеотидной связи также ких температур, а также концентрированных растворов должно произойти соединение двух нуклеотидов с откислот или щелочей, что могло бы привести к образощеплением молекулы воды:

ванию побочных продуктов и разрушению имеющихся и вновь образованных химических связей.

OH OH В настоящее время разработано большое число меBO O P O B1 тодов синтеза пептидов и олигонуклеотидов, удовлетвоO O P O ряющих этим условиям, подобраны удобные защитные OH OH группы и предложены способы активации карбоксильO X ной и фосфатной групп.

O X H + O P OH - H2O ПРИНЦИПИАЛЬНАЯ СХЕМА HO BO O ТВЕРДОФАЗНОГО МЕТОДА СИНТЕЗА BO O P O Синтез протяженных фрагментов белков и нуклеиновых OH кислот состоит из большого числа стадий. После проHO X ведения каждой химической реакции нужно выделить HO X ХАЛИМСКАЯ Л.М. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ХИМИЯ полученный продукт, очистив его от не вступивших в ре- Стадия 6. Выделение и очистка синтезированного акцию исходных веществ и других примесей. Это делает фрагмента белка или нуклеиновой кислоты с помощью процесс длительным и трудоемким, а также приводит к различных хроматографических и электрофоретичесзначительным потерям на каждой стадии выделения. ких методов. (Из-за неполноты протекания реакций к концу синтеза на носителе накапливаются более коАмериканский ученый Роберт Меррифилд в 1962 гороткие фрагменты цепи, поэтому необходима тщательду предложил оригинальную идею твердофазного метоная очистка конечного продукта.) да синтеза, которая позволила резко упростить и ускорить проведение процесса. Идея заключается в том, что СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ первый мономер (аминокислоту или нуклеозид) приТВЕРДОФАЗНЫМ МЕТОДОМ соединяют к нерастворимому полимерному носителю (твердой фазе), который помещают в колонку-реактор.

Р. Меррифилд осуществил синтез нескольких пептиРаствор, содержащий второй мономер и другие необдов и фермента рибонуклеазы твердофазным метоходимые реагенты, пропускают через колонку. При дом, за что в 1984 году ему была присуждена Нобелевэтом образовавшийся продукт реакции также оказываская премия.

ется присоединенным к твердой фазе. Затем колонку Рассмотрим применение принципиальной схемы промывают растворителем для удаления непрореагитвердофазного метода к синтезу пептидов.

ровавших веществ и побочных продуктов, после чего Стадия 1. Получение защищенных аминокислот.

через реактор пропускают следующий мономер, повтоДля блокирования аминогрупп часто используют ряя процедуру многократно до завершения синтеза жетрет-бутилоксикарбонильную группу (сокращенное лаемого продукта.

английское обозначение – Вoc):

Таким образом, растущая полимерная цепь в проO цессе синтеза закреплена на твердой фазе, и все реакции с другими компонентами, находящимися в раство+ R'O C Cl NH2CHCOOH ре, протекают на поверхности носителя. Этот прием R позволяет заменить сложные и трудоемкие процедуры разделения и очистки промежуточных продуктов элеO ментарными операциями промывки полимера.

R'O C HNCHCOOH + HCl Синтез включает в себя несколько принципиальных стадий. R (Boc) Стадия 1. Получение защищенных мономеров, которые являются исходными блоками для построения R' = (CH3)3C цепочки белка или олигонуклеотида. Для этого те фрагменты молекул, которые не должны подвергаться Таким образом защищают аминогруппы всех амихимическим превращениям, блокируют специальнынокислот, входящих в данный пептид или белок. Неми защитными группами.

которые боковые радикалы R аминокислот содержат Стадия 2. Присоединение концевого мономера (зафункциональные группы (например, амино- или карщищенной таким образом аминокислоты или нуклеобоксильные), способные участвовать в реакциях с обзида) к полимерному носителю. Гранулы носителя с разованием побочных продуктов, поэтому их также неприсоединенным концевым мономером вносят в кообходимо блокировать.

лонку-реактор.

Стадия 2. Присоединение концевой аминокислоты Стадия 3. Удаление защитной группы с концевого к полимерному носителю, например к полистиролу с мономера. Для этого через колонку пропускают раствор введенными в него хлорметильными группами.





реагента, вызывающего отщепление защитной группы.

Стадия 3. Удаление Вoc-защитной группы с присоСтадия 4. Проведение конденсации, для чего через единенной к полимерному носителю аминокислоты колонку пропускают раствор второго мономера в смемягкой кислотной обработкой полимера.

си с активирующим реагентом.

Стадия 4. Проведение реакции образования пепСтадии 3 и 4 повторяют многократно до получения тидной связи. Через колонку пропускают раствор, собиополимера необходимой длины. Затем проводят стадержащий аминокислоту с защищенной аминогруппой дии 5 и 6.

в смеси с реагентом, который обеспечивает активацию Стадия 5. Обработка носителя реагентами, приво- карбоксильной группы. В качестве такого реагента дящими к отщеплению синтезированного продукта от Меррифилд использовал дициклогексилкарбодиимид твердой фазы и удалению всех защитных групп. C6H11N=C=NC6H11.

СОРОСОВСКИЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЖУРНАЛ, ТОМ 6, №10, ХИМИЯ трансформироваться при наращивании олигомерной + BocNHCHCOOH Cl CH2 P (2) цепи, поэтому их нужно предварительно блокировать.

Rn Затем одну из гидроксильных групп нуклеозида защищают диметокситритильной группой (DMTr):

H+ BocNHCHCOO CH2 P (3) C6H5 C6HRn B* B* + Ar C Cl HO Ar C O O O BocNHCHRn - 1COOH H2NCHCOO CH2 P Ar Ar C6H11N=C=NC6H(4) Rn OH OH (DMTr) Ar = CH3O BocNHCHCO NHCHCOO CH2 P … Rn - 1 Rn В* – защищенный гетероцикл В связи с тем что реагент содержит объемные заместиP – Полимерный носитель тели, реакция протекает только по одной стерически Затем вновь удаляют защитную группу (стадия 3), более доступной ОН-группе нуклеозида.

добавляют следующий защищенный мономер и актиВ качестве мономеров, используемых для синтеза вирующий реагент (стадия 4) и т.д. Стадии 3 и 4 повтофрагментов ДНК, применяют амидофосфиты нуклеозиряют до тех пор, пока не закончится синтез требуемого дов, поэтому метод синтеза называют амидофосфитным.

пептида. Каждый цикл длится несколько часов.

Эти соединения, содержащие трехвалентный фосфор, В настоящее время в пептидном синтезе применя- являются более активными по сравнению с производными пятивалентного фосфора. Амидофосфитные моноют более эффективные конденсирующие реагенты на основе солей фосфония и урония, что позволяет сокра- меры получают из защищенных нуклеозидов:

тить время синтеза одной пептидной связи (стадия 4) B* Cl B* DMTrO DMTrO O O до 10–15 мин.

+ R'O P - HCl После окончания синтеза удаляют защитные групNRпы, введенные в боковые радикалы R, затем в более жеOH O стких кислых условиях отщепляют с полимерного ноR'O P сителя полученный пептид (стадия 5) и проводят его CHочистку (стадия 6).

NRR = CH R' = CNCH2CHСИНТЕЗ ФРАГМЕНТОВ ДНК CHТВЕРДОФАЗНЫМ Стадия 2. Присоединение концевого нуклеозида к АМИДОФОСФИТНЫМ МЕТОДОМ полимерному носителю осуществляют через так назыОсновной вклад в развитие олигонуклеотидного синваемую якорную группу, которая связывает нуклеозид с теза внес Г. Корана, осуществивший в начале 60-х годов твердой фазой (обычно остаток янтарной кислоты). В химический синтез фрагментов нуклеиновых кислот качестве полимерного носителя используют стеклянзаданной последовательности и получивший за эту раные гранулы.

боту в 1968 году Нобелевскую премию. В 1970 году он Стадия 3. Удаление защитной группы с присоедивпервые синтезировал полный ген аланиновой трансненного к полимеру нуклеозида с помощью мягкой портной РНК.

кислотной обработки:

В 1975 году Р. Летсингер предложил новый метод B*n HO O B*n DMTrO образования межнуклеотидной связи, на основании O H+ которого в начале 80-х годов М. Карузерс разработал так называемый твердофазный амидофосфитный меO O тод синтеза олигонуклеотидов (см. ниже). С этого времени начались бурное развитие этого метода и его ав- Якорная группа P P томатизация. Рассмотрим основные стадии процесса.

P – Полимерный носитель Стадия 1. Получение защищенных исходных мономеров для олигонуклеотидного синтеза. В трех из Стадия 4. Образование межнуклеотидной связи.

четырех входящих в состав ДНК нуклеозидов (A, G и Конденсация гидроксильной группы связанного с поС) гетероциклы содержат аминогруппы, которые могут лимером нуклеозида с амидофосфитным производным ХАЛИМСКАЯ Л.М. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ХИМИЯ второго нуклеозида осуществляется в присутствии ак- Автоматические синтезаторы включают в себя ретивирующего реагента – тетразола. Затем атом трехва- актор, содержащий носитель с присоединенным к нелентного фосфора должен быть окислен до пятива- му первым мономером, и сосуды с необходимыми молентного состояния иодом в присутствии воды: номерами, реагентами и растворителями. С помощью насоса растворы из этих сосудов поочередно подаются B*n - 1 HO O B*n - HNRDMTrO в реактор в соответствии с имеющейся программой и O + заданной последовательностью синтезируемого фрагHN N мента белка или нуклеиновой кислоты. В настоящее N N O O время автоматические синтезаторы пептидов и олиго(Тетразол) нуклеотидов выпускают различные, в том числе и отеR'O P P чественные, фирмы.

NRЗАКЛЮЧЕНИЕ B*n - 1 I2 + H2O DMTrO O B*n - DMTrO O Для современной биоорганической химии синтез пептидов и олигонуклеотидов, содержащих 30–40 мономерO O ных звеньев, не является сложной задачей. Как правило, R'O P R'O P O твердофазным методом синтезируют олигонуклеотиды B*n B*n длиной около 40 звеньев. Использование специальных O O O O ферментов позволяет соединять их в гены, включающие до 2 тыс. пар нуклеотидов. Путем экспрессии генов O O с помощью методов генетической инженерии сейчас получают значительные количества труднодоступных P P белков и пептидов, а также их аналогов.

Pages:     || 2 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.