WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |

Нами разработана методика прижизненного исследования клеток раны с использованием многовекторного знакопеременного микроэлектрофореза (Патент РФ № 2168176 Авторы: Соловьев А.А. и др.).

Методика детализирована в ходе экспериментов на белых крысах и в последующем использована в клинике.

Сущность экспериментов в том, что на коже спины взрослых крыс делали три поперечных разреза на расстоянии не менее 1см друг от друга.

После этого на области двух ран 2 раза в сутки наносили растворы репарантов. В качестве контроля по той же схеме на одну из ран наносили 0,9% раствор хлорида натрия. Ежедневно в течение 6 суток делали мазкиотпечатки из области ран. При этом полученные клетки исследованы прижизненно с помощью знакопеременного микроэлектрофореза.

Результаты анализов заносили в таблицы, подвергали статистической обработке. По окончанию эксперимента проводили патоморфологическое исследование регенерации эпидермиса и дермы из каждой раны.

Репаранты, обеспечивающие оптимальную регенерацию кожи использовали при лечении ран кожи больных, обусловленных механическими факторами воздействия без осложнений.

Результаты исследования показали, что обозначенные Фармацевтическим комитетом РФ репаранты, обеспечивают полноценную регенерацию кожи в короткие сроки. Использованное нами прижизненное исследование клеток из области раны позволяет в ходе цитологического мониторинга раны проводить модельные опыты in vitro для исследований реакций клеток на действие репарантов. Такая возможность предоставляется и при исследовании мазков-отпечатков больных.

Цитологический профиль раны животных на 5-6 сутки согласуется с патоморфологическими исследованиями регенерации эпидермиса и дермы.

Таким образом, предложенная нами методика прижизненного исследования раны расширяет возможности в оценке эффективности репарантов в ходе регенерации раны.

Степанов В.А., Ватазин А.В., Василенко И.А., Метелин В.Б.

ДИАГНОСТИКА РЕАКЦИИ ОТТОРЖЕНИЯ ПОЧЕЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА НА ОСНОВЕ РАСЧЕТНОГО ИНДЕКСА АКТИВАЦИИ КЛЕТОК ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимировкого, Москва Острое отторжение - один из главных факторов, вызывающий гибель функционирующей почечной ткани у реципиента. Тяжесть перенесенных реакций отторжения напрямую корррелирует с потерей массы действующих нефронов. Своевременное выявление иммунологического конфликта и адекватное его лечение призвано сохранить функцию ренального трансплантата.

Целью настоящего исследования явилась оценка возможности использования компьютерной фазовой морфометрии лимфоцитов в диагностике иммунологического конфликта.

Материалы и методы. Нами было исследовано 60 случаев (мужчин и 30 женщин) клинического течения раннего послеоперационного периода у реципиентов трупного почечного аллотрансплантата. Возраст больных от 23 до 56 лет (средний возраст 36,4±11,2). Среднее время холодовой ишемии составляло 23,5±3,5 часа. Среднее число совпадений донорской почки и реципиентов по системе HLA составляло 3±0,антигена. Все пациенты получали стандартную четырхкомпонентную компонентную схему иммуносупрессии, включавшую Зенапакс, ММФ, преднизолон и ингибиторы кальцийнейрина. Проводилось стандартное обследование. Оценка биопсийного материала проводилась по критериям гистологической классификации Banff 97. Иммунокомпетенные клетки крови выделяли из периферической крови на 0-е (до трансплантации), 3-5, 7-9, 12-14, 18-20 и 23-25 сутки. Разделение мононуклеаров проводили по стандартной методике. Исследование витальной морфометрии иммунокомпетентных клеток проводили на фазово-интерференционном микроскопе «Цитоскан» (МГИРЭА, Москва). Статистический анализ проводился с помощью алгоритмов MatLab и пакета Statistika 6.

Результаты и обсуждение. У 13 больных по данным прижизненной компьютерной фазовой морфометрии Т-лимфоцитов периферической крови мы наблюдали увеличение диаметра, периметра, площади, при уменьшении высоты и объема. Так, величина диаметра Т-лимфоцита по сравнению неосложненным течением увеличилась в среднем на 4,2%, периметр и площадь - на 10,8% и на 8,4%, соответственно. Динамика высоты и объема имела противоположную направленность: высота уменьшилась на 15,8%, а объм - на 6,2%. По данным биопсийного исследования диагностирован иммунологический конфликт.

Однако, несмотря на статистически достоверные изменения в каждом наблюдении по отношению к группе сравнения (пациенты с неосложненным течением послеоперационного периода), разница между ними настолько незначительна, что не позволяло клиницисту однозначно трактовать полученные результаты.

Для оптимизации мониторинга иммунореактивности реципиентов почечного аллотрансплантата в раннем послеоперационном периоде нами предложен расчетный индекс, характеризующий функциональное состояние иммунокомпетентных клеток периферической крови. Уровень активации лимфоцитов, связанный с изменением структуры хроматина в ядре клетки находит объективное отражение в характере изменения фазового портрета и может быть количественно просчитан по степени увеличения диаметра и/или периметра лимфоцита при одновременном снижении его фазовой высоты. Следовательно, отношение: h / d, где h - фазовая высота ядра; d - диаметр клетки, представляет собой индекс активации клеток (ИАК). В то же время, при введении показателя ИАК эти же данные можно оценивать без дополнительных статистических обработок. ИАК в группе с иммунологическим конфликтом увеличивался с 3,8 ± 2,9% до 19,0 ± 5,9%, т.е. почти в пять раз.

Заключение. Полученные результаты позволяют утверждать, что расчтный индекс ИАК может успешно использоваться при диагностике острой реакции отторжения у реципиентов почечного аллотрансплантата, что существенно облегчает работу врача-клинициста.

Степанов В.А., Ватазин А.В., Крстич М.Д., Валов А.Л.

МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК ПРИ ТЕРАПИИ РЕАКЦИИ ОТТОРЖЕНИЯ НЕФРОТРАНСПЛАНТАТА ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимировкого Первые результаты компьютерной морфометрии при оценке иммунного статуса реципиентов почечного трансплантата, полученные в 2003 – 2005 г.г., оказались весьма обнадеживающими. Было показано, что применение современных оптических компьютерных лазерных систем для витального исследования морфофункционального состояния клеток крови отвечают требованиям минимальной инвазивности, информативности и оперативности получения результата. Поскольку действие большинства иммуносупрессивных препаратов, в основном, направлено на подавление активности лимфоцитов, возможность мониторинга состояния иммунных клеток крови в режиме реального времени - важная задача клинической трансплантологии.

Цель настоящей работы - оценка эффективности лечения острого отторжения с использованием морфометрических показателей лимфоцитов периферической крови. Проанализировано 13 случаев (6 мужчин и женщин) острой реакции отторжения у реципиентов трупного почечного аллотрансплантата в раннем послеоперационном периоде. Возраст больных от 19 до 47 лет (средний возраст 26,4±6,2). Время холодовой ишемии было в среднем 23,5±3,5 часа. Среднее число совпадений по системе HLA 3±0,6 антигена. Противокризовая терапия проводилась мг метилпреднизолона в течение 3-х дней, а при ее неэффективности - АТГ в дозе 5мг/кг сроком до 14 дней. Оценка биопсийного материала проводилась по критериям гистологической классификации Banff 97.

Иммунокомпетентные клетки крови выделяли из периферической крови на момент диагностирования реакции отторжения, на 3-5, 7-9, 12-14, 18-сутки от начала лечения. Разделение мононуклеаров проводили по стандартной методике. Исследование витальной компьютерной морфометрии (КФМ) иммунокомпетентных клеток проводили на фазовоинтерференционном микроскопе «Цитоскан» (МГИРЭА, Москва). Для оценки функционального состояния иммунокомпетентных клеток периферической крови мы применили расчетный индекс активации клеток (ИАК). Уровень активации лимфоцитов определяли по формуле h/d, где h - фазовая высота ядра; d - диаметр клетки. В группе больных с иммунологическим конфликтом мы наблюдали увеличение ИАК в популяции Т-лимфоцитов с 3,8 ± 2,9% до 19,0 ± 5,9%, т.е. почти в пять раз по сравнению с группой реципиентов неосложненного посттрансплантационного периода. При этом В-клеточное звено оставалось без изменений. На фоне эффективной противокризовой терапии у 12 пациентов (восстановление функции трансплантата) отмечалось нормализация всех фазовых морфометрических показателей циркулирующих Т-лимфоцитов. У одного пациента, несмотря на активное лечение, в связи с не купируемым кризом отторжения было проведено удаление трансплантата. При этом нормализация фазовых величин Тлимфоцитов при КФМ не наблюдалось.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности применения морфометрических показателей лимфоцитов для оценки эффективности проводимой противокризовой терапии у реципиентов нефротрансплантата.

Сухенко Е.П., Лисицын Н.Б., *Кирьянов Н.А., *Ильченко К.В., **Пономарев А.Ю., **Хусейн Х.С., **Черкасов В.А., Кузнецов С.И.

ОБ ИНФОРМАТИВНОСТИ, ТОЧНОСТИ И ТИПОВЫХ ПОКАЗАТЕЛЯХ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ЖИВЫХ КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ КОМПЛЕКСА «ЦИТО-ЭКСПЕРТ» И ДРУГИХ ПРИБОРОВ НТУ «Инженерно-технический центр», Ижевск *Ижевская государственная медицинская академия, Ижевск **Пермская государственная медицинская академия, Пермь За последние два года при помощи комплекса «Цито-Эксперт» проведено немалое количество анализов электрокинетической активности различных видов клеток в автоматизированном режиме, с обработкой полученных данных средствами программного пакета NTUComplex. Для адекватной интерпретации результатов весьма немаловажен вопрос о точности измеряемых показателей, которая в немалой степени определяет информативность как полученных результатов, так и самого метода измерений.

При этом следует иметь в виду, что предметом анализа являются живые объекты с их индивидуальными биоритмами, метаболизмом, реакциями на раздражители и т.п. Поэтому адекватная оценка точности измерений с учетом этих факторов может производиться только в зонах относительной временной стабильности данных объектов и измеряемых показателей.

Кроме того, весьма важны правильная пробоподготовка и неукоснительное исполнение технологии проведения анализа, включая правильность разведения цельной крови в буферном растворе, оперативность видеосъемки после подачи напряжения на электроды электрофоретической камеры, точное дозирование гепарина и своевременное перемешивание пробы. К этому можно добавить необходимость использовать в качестве покровных стекла для камеры Горяева и рекомендацию выдерживать кровь после разведения в растворе не менее 10 мин. для стабилизации морфологических форм клеток и меняющихся парциальных концентраций основных ионов в цитоплазме.

Специальные проверки показали, что при соблюдении этих рекомендаций суммарная погрешность измерений основных показателей электрокинетической активности – доли подвижных клеток и амплитуды их колебаний – не превышает 6-8 % для клеток крови и 10-15 % для клеток хлореллы (в популяции клеток водоросли Chlorella vulgaris Bejer существует видовое разнообразие, которое вызывает больший разброс показателей).

Что касается уровней нормы и патологии для показателей клеток крови, полученные на сегодня их типовые значения представлены в таблице.

Доля Аср.(кап.), Аср.(вен.), Асиммет- Эксцесс Источ- Контингент подвижн., мкм мкм рия (вен.) (вен.) ник % Новорожденные Палагин В.А.

23,8 - 95,8 - - (45 чел.) и др., Здоровые дети Палагин В.А.

1-17 лет (40 21,8 - 91,0 - - и др., чел.) Доноры 86,2 кап. Данные 24-59 лет 19,7 18,5 0,02 1,84,0 вен. авторов (30 чел.) Больные эмпиемой плевры Данные - 2,7 () 46,1-59,7 0,15 () 0,24 () (при поступлении, авторов 35 чел.) Здесь в 1-й и 2-й колонках даны значения средних амплитуд колебаний клеток для капиллярной и венозной крови при стандартных значениях напряжения на электродах электрофоретической камеры (28 В) и частоты смены полярности напряжения (0, 25 Гц), далее доля подвижных клеток, асимметрия и эксцесс гистограммы амплитуд. Колонки расположены в порядке убывания информативности и значимости соответствующих показателей. Последние два показателя характеризуют степень симметрии гистограммы амплитуд (или распределения клеток популяции по величине их электрических зарядов) относительно ее центра, и степень ее пирамидальности. Эти два показателя в последнее время привлекают внимание исследователей тем, что они могут использоваться для дифференциальной диагностики ряда патологий.

Здесь необходимо отметить, что данные измерения проводились в постоянном электрическом поле на приборе «Пармаквант» (ФРГ). Он является близким аналогом другого прибора, работающего на постоянном поле – «Цитоферометра» фирмы Оптон (ФРГ), точность измерений которого составляет 4 %. Представляется, что достоверность и информативность показателей асимметрии и эксцесса достаточно сильно зависят от точности измерений, поскольку их значения, по нашему опыту, довольно чувствительны к изменениям настроечных параметров компьютерной программы обработки, с помощью которой они рассчитывались в наших исследованиях при измерениях с точностью 6-8%.

Вместе с тем, приведенный в таблице средний для группы доноров показатель асимметрии, полученный с помощью комплекса «ЦитоЭксперт», практически точно совпадает с его значением в работе для здоровых людей, а показатель эксцесса отличается от соответствующего показателя в этой работе (0,09) на величину, сравнимую с его значением для некоторых патологий. На данном этапе трудно сказать, является ли это отклонение следствием недостаточной для этого параметра точности измерений, или же следствием того, что не все доноры достаточно здоровы (доноры не принадлежали к категории «активных», т.е. состоящих на регулярном учете).

В любом случае, до появления достаточного количества надежных и статистически достоверных данных измерений показателей асимметрии и эксцесса мы рекомендуем пользователям комплекса «Цито-Эксперт» использовать их, в основном, только для качественных и полуколичественных оценок.

Что касается основных показателей электрокинетической активности, в таблице заметно постепенное синфазное их снижение с возрастом и резкое снижение при изучаемой патологии (показатели последней строки нуждаются в дальнейшем уточнении ввиду нестандартной пробоподготовки).

В целом же, при сравнении результатов, полученных при измерениях электрокинетической активности любых объектов в постоянном и переменном полях, необходимо учитывать, что эти способы измерений родственны, но не идентичны. Основным показателем при измерениях в постоянном поле является электрофоретическая подвижность (ЭФП). По определению [5], ЭФП есть скорость перемещения заряженных объектов в однородном постоянном электрическом поле при единичной напряженности этого поля, обозначается U. Если напряженность поля не равна единице, имеем:

v U= (1) E где: v (мкм/с) – значение постоянной скорости перемещения объекта в поле; Е (В/см) – значение напряженности постоянного электрического поля.

В случае переменного поля скорость объекта непостоянна, т.к.

определяется зависящей от времени напряженностью этого поля. Однако могут быть использованы значение средней скорости vср, определяемой через амплитуду и время полупериода колебаний объекта в поле, а также значение амплитуды напряженности Еа переменного поля.

Если выразить vср и Eа через амплитуду колебаний объектов, время или частоту перемещений и напряжение на электродах камеры, получим, по аналогии с (1):

Ua= 4A*F мкм*см (2) V В*с где: А (мкм) - измеренная амплитуда колебаний объектов; F (Гц=1/c) – заданная на дисплее «Цито-Эксперта» частота переключения направления электрического поля; V (В) – заданное на дисплее значение амплитуды импульсов напряжения на электродах камеры.

Величина Uа имеет почти тот же физический смысл, что и U в формуле (1), и характеризует среднюю скорость движения объектов в переменном поле при амплитуде переменного напряжения (прямоугольной формы), равной 1 В.

Если использовать рекомендуемые для анализа клеток крови стандартные значения частоты (0,25 Гц) и напряжения на электродах (В), то, согласно формуле (2), в этом случае связь между амплитудой колебаний и электрофо-ретической подвижностью клеток в переменном поле выражается простым соотношением: Ua = A/28 (мкм • см/В • с) Для других значений частоты и напряжения знаменатель этой формулы будет другим.

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.