WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 11 |

Новые возможности метода КФМ проявились в:

- исследовании живых, неокрашенных клеток;

- получении более четких границ цитоплазмы, ядра, ядрышек, что позволило произвести точные морфометрические измерения размеров ядра, ядрышек в полуавтоматическом режиме;

- измерении ядрышко-ядерного соотношения суммы значений фазовой толщины; которое в клетках папиллярного рака щитовидной железы в 2 раза больше, чем в нормальных клетках;

- получении объемных изображений клеток, исследовании поверхностей клеток и ядер, при этом раковые клетки имели неправильную форму и бугристую поверхность;

- исследовании оптических свойств ядра и цитоплазмы, что позволило более детально изучить структуру цитоплазмы, хроматина, определить вутриядерные включения. В ядрах обнаруживаются включения цитоплазменной природы, что особенно важно в диагностике папиллярного щитовидной железы.

Измерение флуктуаций фазовой толщины (ФТ) позволило получить дополнительную информацию о функциональном состоянии живых клеток, свидетельствующую о различии метаболических процессов в нормальных и раковых клетках.

В «нормальных» клетках щитовидной железы и клетках папиллярного рака наблюдались периодические изменения функциональной активности в ядрышке, ядре и цитоплазме: при снижении метаболических процессов в ядре они увеличивались в цитоплазме, и наоборот. Эти изменения сопровождались явлениями секреции.

Использование АСМ позволило получить различия для нормальных клеток и клеток папиллярного рака щитовидной железы. Новые возможности проявились в разнице микрорельефа поверхностей опухолевых клеток. При папиллярном раке на поверхности ядра клеток в отличие от нормальных клеток четко определяются от 1 до 4 ядрышек высотой от 50 до 150нм. В ядрах части клеток папиллярного рака определяются внутриядерные включения цитоплазмы, глубина которых позволяет дифференцировать их с дистрофическими изменениями.

Таким образом, преимущество методов КФМ и АСМ состоит в возможности объективизировать данные цитологического исследования, получить количественные значения морфологических параметров и на их основании делать статистически более достоверные выводы о патологическом процессе и прогнозе его течения.

Вышенская Т.В., Василенко И.А., Метелин В.Б., Тычинский В.П.

ФАЗОВАЯ ТОЛЩИНА КАК ХАРАКТЕРИСТИКА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, ГУ Московский областной научно-исследовательский институт им. М.Ф..

Владимирского, Московский государственный институт радиотехники, электроники и автоматики (ТУ).

С развитием качественно нового типа оптической микроскопии – фазовой, появилась возможность анализировать состав клеточных суспензий по оптическим свойствам отдельных клеток в реальном времени и без использования красителей. Для описания оптических свойств клетки был введен параметр фазовой толщины, пропорциональный ее рефрактерности (разности показателей преломления клетки и окружающей среды). Фазовое изображение каждой клетки получали с помощью Когерентного Фазового микроскопа (КФМ) и измеряли ее фазовую толщину. Метод КФМ и его применение в биологии и медицине подробно изложены в работах последних лет. Измерения проводили на суспензии Тлимфоцитов, выделенных из периферической крови 4 доноров.

По измерениям фазовых толщин отдельных клеток была построена гистограмма, из которой видно, что в суспензии присутствуют по крайней мере 3 субпопуляции клеток.

Дальнейшие эксперименты с фитогемагглютенином (2 мкг/мл) показали, что нижний пик h = 115± 20 нм принадлежит активированным Т-лимфоцитам, а верхний h = 175± 25 нм превалирует у здоровых доноров.

Таким образом, фазовая толщина отдельных клеток в суспензии несет количественную информацию о их статусе, и это явление может быть положено в основу новых методов экспресс-диагностики функционального состояния клеток.

Галкин А.А., Агафонов В.А., Демидова В.С.

ДВА ТИПА НАРУШЕНИЙ ОСМОРЕГУЛЯЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ У БОЛЬНЫХ С ГАСТРОИНТЕСТИНАЛЬНОЙ ФОРМОЙ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА.

ФГУ "Институт хирургии им.А.В.Вишневского Росмедтехнологий", Москва, Россия Пищевые токсикоинфекции - удобная модель для изучения у человека бактериальной интоксикации, не осложненной травмой.

Сальмонеллы наиболее часто становятся причиной пищевой токсикоинфекции. Болезнь протекает остро; два основных синдромокомплекса - интоксикационный и диспептический определяют скорость развития и тяжесть заболевания. Нейтрофилам отводится одно из центральных мест в процессах детоксикации и нейтрализации бактериальных липополисахаридов (ЛПС) в системном кровотоке.

Развитие интоксикационного синдрома при сальмонеллезе отражается на функциональном состоянии нейтрофилов крови изменением адгезивности к субстрату, снижением подвижности (случайное блуждание и хемотаксис) нейтрофилов, ослаблением фагоцитоза и примированием нейтрофилов к активации окислительного метаболизма и секреторной дегрануляции.

В настоящей работе проведено исследование реакции нейтрофилов крови на гипотонический стресс у здоровых доноров и у больных с гастроинтестинальной формой течения сальмонеллеза в 1-2е сутки от начала заболевания - в период, когда наиболее резко проявляются симптомы острой интоксикации. В основу метода положен феномен изменения интенсивности рассеяния света адгезированными на стекле клетками в темном поле микроскопа при действии анизотонических растворов. Интенсивность рассеянного клетками света или светимость монослоя клеток (выражена в относительных единицах) регистрировали с помощью микроскопа Jenalumar (объектив х16) с темнопольным конденсором и встроенного в микроскоп фотоэлемента (ФЭУ-1), усилителя постоянного тока (У7-2) и самописца (КСУ-4).В качестве нормальной клеточной среды использовали раствор Хенкса следующего состава, мМ: NaCl- 133, KCl- 4,6, MgCl2- 0,3, CaCl2- 1,6, глюкоза- 11, HEPES- 10, (осмотичность 300 мосМ). Гипотонический раствор Хенкса (осмотичность 120 мосМ) готовили добавлением дистиллированной воды к исходному раствору Хенкса. Гиперкалиевый раствор Хенкса получали полной заменой ионов Na+ в растворе Хенкса на ионы К+. Все растворы имели рН 7,3, температура 370С.Параллельно с объективной регистрацией светимости клеток проводили по трехбальной шкале оценку адгезии к стеклу, агрегации нейтрофилов между собой, способности к изменению формы (подвижности), характера грануляции. При замене изотонического раствора Хенкса (300 мосМ) на гипотонический раствор (120 мосМ) нейтрофилы здоровых доноров набухают и принимают сферическую форму, интенсивность рассеянного клетками света после небольшого латентного периода резко возрастает и достигает максимума в течение 7-минут. Вслед за фазой набухания клеток развивается фаза релаксации, носящая название регуляторное уменьшение объема; она длится 25-минут, за это время светимость возвращается к исходному уровню или довольно близкому к нему. Регуляторное уменьшение объема нейтрофилов обеспечивается снижением внутриклеточного осмотического давления вследствие выведения ионов K+ и Cl- из клеток по независимым каналам.

Развитие фазы регуляторного уменьшения объема можно заблокировать специфическими блокаторами калиевых и хлорных каналов или при действии гипотонического гиперкалиевого раствора Хенкса. Группу больных составляли пациенты с гастроинтестинальной формой течения сальмонеллеза в 1-2е сутки от начала заболевания. Под нашим наблюдением находилось 30 больных (мужчины и женщины) в возрасте от 21 до 70 лет, диагноз у которых был поставлен на основании клиникоэпидемиологических данных и во всех случаях подтверждался бактериологическим методом. При замене изотонического раствора Хенкса (300 мосМ) на гипотонический раствор (120 мосМ) у больных сальмонеллезом, наряду с нормоподобными реакциями, были выявлены две ярко выраженные формы нарушений осморегуляции нейтрофилов.

Одна из форм реакции нейтрофилов характеризуется полным блокированием регуляторной фазы релаксации (7 больных). Этому типу реакции исходно соответствовали: сильное распластывание клеток на стекле, преимущественно крупная грануляция, хаотическое кипение гранул и отутствие изменений формы клеток. Другая форма реакций нейтрофилов на гипотонию характеризуется трехфазным изменением светового сигнала с очень быстрой фазой набухания (7 больных). Этому типу реакции нейтрофилов на гипотонию исходно соответствовали:

наличие мелких агрегатов нейтрофилов, отсутствие распластывания на стекле и сферическая форма клеток, отсутствие изменений формы клеток, а внутри клеток равномерное пылевидное содержимое, слабо рассеивающее свет. На основании совокупности объективных клиниколабораторных показателей и субъективных жалоб больных (слабость, тошнота, боли в животе, головная боль, сухость во рту, температура тела, рвота, стул, тахикардия, артериальная гипотония, лейкоцитоз, СОЭ) нами были выделены группы больных с относительно тяжелым течением, среднетяжелым, средним, среднелегким и легким течением заболевания.

Распределение реакций нейтрофилов на гипотонический стресс в зависимости от тяжести и вариантов течения заболевания показало, что тип реакции нейтрофилов на гипотонию с отсутствием фазы релаксации наблюдался у относительно тяжелых больных и не наблюдался у больных с легкой и средней степенью интоксикации. Трехфазная реакция проявлялась у больных среднетяжелых и средней тяжести и не наблюдалась у больных с легкой степенью интоксикации. Нормоподобный тип реакции нейтрофилов встречался у легких, средне -легких и больных средней тяжести и не встречался у относительно тяжелых и среднетяжелых больных.

Ни с одним из клинических показателей интоксикации в отдельности реакции нейтрофилов на гипотонию не коррелировали (возможно, за исключением температуры тела, которая у тяжелых больных превышала 380С), но наблюдалась довольно высокая корреляция со всей совокупностью показателей интоксикации.

Обнаружение нами двух ярко выраженных форм нарушения осморегуляции нейтрофилов у больных сальмонеллезом дает основание предполагать существование, как минимум, двух патофизиологических механизмов ответа нейтрофилов на бактериальную интоксикацию.

Причиной отсутствия регуляторной фазы релаксации может быть блокада выведения ионов К+ и Cl- из клеток через соответствующие ионные каналы. В случае трехфазного ответа можно предположить наличие нарушений в цитоскелете, вследствие чего клетки приобретают сферическую форму, теряют подвижность и в ответ на гипотонический стресс очень быстро набухают.

Головкина Л.Л., Атрощенко Г.В., Пушкина Т.Д., Кутьина Р.М., Красникова Н.А., Хамаганова Е.Г., Исаев В.Г., Михайлова Е.А.

ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ НА АНТИГЕНЫ ТРОМБОЦИТОВ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНОВ СИСТЕМ HLA и НРА У ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Гематологический Научный Центр РАМН, Москва Гуморальный иммунный ответ на чужеродные антигены сокращает число совместимых и, следовательно, безопасных трансфузий компонентов крови. Аллоиммунизация реципиентов к антигенам систем НРА (Human Platelet Antigens) и HLA (Human Leukocyte Antigens) I класса является одним из основных иммунологических осложнений трансфузионной терапии тромбоцитами. В инициации гуморального иммунного ответа важную роль играют молекулы HLA II класса, поскольку аминокислотный состав пептидсвязывающих сайтов иммунокомпетентных клеток влияет на презентацию чужеродных белков рецепторам Т-лимфоцитов. HLA-рестриктированные механизмы аллоиммунизации в трансфузиологии изучены не достаточно.

Полиморфизм антигенов, определяемый заменами аминокислот, может влиять на презентацию иммуногенных пептидов антигенпрезентирующей бороздкой молекулы HLA II класса. Цель работы – изучение взаимосвязи НРА и HLA-генотипа больного на антителообразование при трансфузиях тромбоцитов, особенностей распределения НРА- и HLA-генотипов у больных заболеваниями системы крови. Обследовали 29 больных апластической анемией (АА), 18 больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), 19 больных острым миелобластным лейкозом (ОМЛ), доноров. Методы исследования: тканевое типирование локусов HLA-A,-B с помощью тестовых сывороток и методами ПЦР генов локусов HLA-A,B,-DRB1,-DQB1 (низкое и высокое разрешение), генотипирование локусов НРА-1,-2,-3,-4,-5,-6,-15; иммуноферментный анализ с нативными и модифицированными (лишенными HLA) тромбоцитами, микролимфоцитотоксический тест. Результаты. Способность к антителообразованию зависела от нозологической формы заболеваний, которые по частоте аллоиммунизации можно представить в следующем порядке: АА – ОМЛ – ОЛЛ. Определены маркеры предрасположенности к образованию: анти-НРА-1b антител у больных ОЛЛ - ген HLA-DRB1*и генотип HLA-DRB1*0701,-DRB4*,-DQB1*0201-03,-DQB1*0301; антиНРА-5b антител у больных ОМЛ - ген HLA-DQB1*0201-03, полиспецифических анти-HLA антител у больных АА - HLA-DQB1*0301.

У больных ОМЛ с анти-HLA антителами с большей частотой выявляли гены HLA-DQB1*0201-03, HLA-DRB1*0701, HLA-DRB4*. Частота аллоиммунизации не зависела от количества трансфузий, а определялась HLA генами больного. Изучение распределения НРА у больных показало увеличение частоты НРА-3a/b генотипа у больных АА, увеличение частоты аллеля НРА-5b и генотипа НРА-5а/b в 2 раза у больных острыми лейкозами. Относительно распределения HLA установлено: у больных АА – частая встречаемость HLA-А2, -А28, -В18 (70,4%, 7,4%, 25,9%, соответственно), снижение частоты генов HLA-DRB1*01, HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*04, DRB1*13, DQB1*0302 и HLA-DQB1*06; у больных ОЛЛ - снижение частоты генов HLA-DRB1*03, HLA-DQB1*06; у больных ОМЛ – снижение частоты генов HLA-DRB1*01, HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*04.

У больных ОЛЛ и ОМЛ достоверно снижена частота антигена HLA-B15.

Заключение: Аллоиммунизация зависит от нозологической формы заболевания. У больных генетические маркеры предрасположенности к инициации гуморального иммунного ответа на аллоантигены систем HPA и HLA отличаются от маркеров предрасположенности к развитию основного заболевания.

Григорьев А.А., Булычева Т.И., Зацепина О.В.

ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЯДРЫШКОВОГО БЕЛКА КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, ВЫЯВЛЯЕМОГО НОВЫМИ МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ.

Гематологический научный центр РАМН, Москва Ядрышко эукариотической клетки является динамической структурой, в которой происходят транскрипция рибосомных генов (рДНК), процессинг рРНК и сборка прерибосомных субъединиц. Одним из подходов к изучению ядрышка является изучение его белков на иммуноцитохимическом уровне, в основе которого лежит использование специфических моноклональных антител. Однако панель антител к белкам ядрышка в настоящее время является достаточно ограниченной.

Нами получены МКА А3, которые выявляют антиген, локализующийся исключительно в ядрышке клеток человека. Полученные антитела проявляли высокую иммунореактивность при всех тестированных способах фиксации. При этом антитела обладали видовой специфичностью, окрашивая только клетки человека и мартышки.

Однако на иммуноблотах полученные МКА давали множество полос при отсутствии мажорной полосы. В связи с этим для получения представления о природе и функциях А3 антигена была произведена его колокализация с хорошо изученными белками ядрышка. Для этого Аантиген был колокализован с четырьмя ранее идентифицированными ядрышковыми белками: с фибрилларином (белок раннего процессинга рРНК), UBF (Upstream Binding Factor – специфический фактор инициации транскрипции рДНК), Nopp 140 (неспецифический фактор инициации транскрипции рДНК). В результате было установлено, что А3 антиген не колокализовывался полностью ни с фибрилларином, ни с Nopp140, но отмечена его полная колокализация с белком UBF, являющимся обязательным и специфическим компонентом комплекса РНК полимеразы I. Полученные данные указывали на то, что А3 антиген или сходен или входит в состав комплекса РНК полимеразы I, что подтверждается и тем, что А3 антиген во время митоза локализуется в составе ядрышковых организаторов.

Отличительной особенность А3 антигена явилась его миграция из ядрышка в нуклеоплазму при обработке клеток ингибиторами синтеза белка (анизомицин, эметин, циклогексимид, пуромицин). При увеличении времени инкубации с ингибиторами трансляции (от 1 до 4 часов) увеличивалась не только количество клеток с релокализацией А3 антигена, но и появлялись и постепенно увеличивались в количестве апопототические клетки.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 11 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.