WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 |   ...   | 16 | 17 || 19 | 20 |   ...   | 23 |

Уже в ранних работах было обнаружено, что начальная скорость ферментативной реакции, при фиксированной концентрации фермента и малых концентрациях субстрата, изменяется линейно с концентрацией субстрата, но для высоких концентраций субстрата скорость реакции уже не зависит от его концентрации.

Л. Анри (1903 г.) первым предложил идею, что фермент образует с субстратом промежуточный комплекс. Развил эту идею Л. Михаэлис.

Согласно этой идее, механизм процесса можно представить состоящим из двух стадий. Первая — обратимая и быстрая, вторая — необратимая и медленная:

kk ES E + S P + E kДля данного механизма скорость реакции определяется скоростью образования продукта реакции Р:

dcP v k2cES. (10.1) dt Скорость образования промежуточного продукта ES равна:

dcES. (10.2) k1cScE k1cES k2cES dt Уравнения материального баланса для фермента и субстрата имеют вид:

0 cE cE cES и cS cS cES, (10.3) 0 где cE и cS — начальные концентрации фермента и субстрата;

cE и cS — их текущие концентрации; cES — концентрации промежуточного соединения и продукта реакции.

Решение системы из трех уравнений (10.1)–(10.3) находим из следующих условий:

1) для t 0, P 0, следовательно cS cS cES;

0 0 2) обычно cS >> cE, поэтому cS cS ;

3) считают, что концентрация промежуточного соединения cES стационарна (на основе принципа стационарности Боденштейна), dcES т. е. 0.

dt Подставляя значение cES из (10.3) в (10.2) и решая его относительdcES но cES при условии 0, получим:

dt 0 k1cEcS cES. (10.4) k1cS k1 kПоделим числитель и знаменатель этого уравнения на k1, тогда имеем:

0 cEcS cES. (10.5) cS KM k1 kВеличину KM принято называть константой Михаэлиса.

kПодставляя уравнение (10.5) в (10.1), получим уравнение для скорости образования продукта в начальный момент времени:

0 k2cEcS v0. (10.6) cS KM Анализ уравнения (10.6) позволяет объяснить наблюдаемые на опыте закономерности:

1) если cS KM, тогда k2cE v0 cS, (10.7) KM то есть начальная скорость линейно зависит от концентрации субстрата.

Этот факт полностью подтверждается экспериментальными данными;

2) если cS KM, тогда из уравнения (10.7) получаем:

v0 vmax k2cE, (10.8) то есть начальная скорость не зависит от концентрации субстрата, что так же соответствует опытным данным. Следовательно, порядок реакции по субстрату в этом случае будет нулевой, а скорость процесса достигает максимального значения. Поэтому уравнение (10.6) можно записать в виде:

vmaxcS v0. (10.9) cS KM Уравнение (10.9) в литературе известно как уравнение Михаэлиса– Ментена. KМ называется константой Михаэлиса, физический смысл которой можно сформулировать, анализируя уравнение (10.9).

Константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата ( KM cS ), при которой активность фермента составляет половину максимальной, т. е. v0 vmax / 2, и имеет размерность концентрации, моль/дм3. Численные значения KМ обычно лежат в пределах 10–2–10–8 М, легко воспроизводятся и не зависят от концентрации фермента. В то же время KМ является функцией температуры, рН среды, зависит от присутствия других веществ, играющих роль ингибитора или активатора.

Если для рассматриваемого механизма реакции выполняется услоkвие k1 >> k2, тогда KM KS, где KS — субстратная константа, kт. е. константа диссоциации фермент-субстратного комплекса на фермент и субстрат, характеризующая меру связывания фермента с субстратом. В общем случае KM KS, причем экспериментальное значение KM представляет собой максимальное значение KS.

Только для ферментов разложения пероксида водорода, каталазы и пероксидазы, для которых k1 << k2, константа Михаэлиса KM k2 / kсильно отличается от субстратной константы KS.

Величину k2 (размерность [t–1]) называют также числом оборотов фермента, так как она указывает на число моль субстрата, превращенных в продукт одним молем фермента в единицу времени. Для сложных реакций константу k2 в уравнении Михаэлиса–Ментена обычно заменяют на kкат — каталитическую константу с той же размерностью.

Для определения параметров KM и vmax используют несколько способов лионеризации уравнения Михаэлиса–Ментена.

Первый способ (способ Лайнуивера–Берка) Уравнение (10.9) приводят к виду:

1 1 KM. (10.10) v0 vmax vmax cS 1 График прямой, построенной в координатах, отсекает отреv0 cS зок на оси ординат, равный. Тангенс угла наклона прямой равен vmax KM. Константу KM можно определить по отрезку, отсекаемому прямой vmax на оси абсцисс, так как при 0 имеем соотношение:

v1 KM, vmax vmax cS откуда KM cS.

Второй способ (вторая форма уравнения Лайнуивера–Берка) Уравнение (10.10) умножают на cS :

cS KM cS. (10.11) v0 vmax vmax cS График в координатах –cS представляет собой также прямую, vKM отсекающую на оси ординат отрезок, равный, а на оси абсцисс — vmax отрезок, равный KM.

Третий способ (способ Эдди–Хофсти) Если умножить обе части уравнения (10.10) на (vmaxv0 ), то оно приводится к виду:

v v0 vmax KM 0. (10.12) cS vГрафик, построенный в координатах v0, дает прямую линию, cS тангенс угла наклона, которой равен KM, а отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен vmax. Кроме того, отрезок, отсекаемый на оси абсцисс, vmax v0 vmax vравен, так как при v0 0 vmax KM 0 или.

KM cS KM cS Указанные способы лианиризации уравнения Михаэлиса–Ментена охватывают различные области концентрации субстрата, когда возможны отклонения от линейности. Поэтому полезно значения KM и vmax, определенные различными способами, сравнивать между собой.



Нетрудно показать, что аналогичная (10.9) форма уравнения может быть получена и для более сложных механизмов реакции. Например, когда субстрат взаимодействует с ферментом по схеме:

kk ES ES1+ X k E + Y E + S kВыражение для начальной скорости имеет вид:

0 k2cEcS v0, (10.13) KM cS kгде. Это уравнение аналогично по форме уравнению Михаk2 kэлиса–Ментена и также легко линеаризуется.

Возможно протекание более сложных ферментативных реакций с участием двух субстратов.

10.2. ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ НА КИНЕТИКУ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ Вещества, присутствие которых в системе понижает активность фермента, то есть уменьшает скорость реакции, называются ингибиторами.

Эффект ингибирования может происходить по разным причинам.

1. Ингибитор I конкурирует с субстратом за активный центр, так как по строению близок к нему и является псевдосупстратом, образуя с ферментом неактивный комплекс:

k EI E + I kКонстанта диссоциации комплекса ЕI называется константой ингибирования:

cEcI KI.

cEI Начальная скорость реакции в присутствии ингибитора всегда меньше, чем при его отсутствии.

Если при увеличении концентрации субстрата в растворе активность фермента восстанавливается, такое ингибирование называется конкурентным.

Предельное значение скорости не зависит от присутствия ингибитора:

vmax k2cE.

Уравнение Михаэлиса–Ментена в присутствии ингибитора в этом случае имеет вид:

vmaxcS v0, (10.14) cS KM,эф где cI KM,эф KM — (10.15) 1 KI эффективная константа, зависящая от cI и KI.

0 Если cI KI и cS KM, то скорость реакции ингибирования будет равна vmax /3.

Выражение для константы ингибирования выразим из (10.15):

cI KI. (10.16) KM,эф / KM Таким образом, для определения KI, кроме cI,необходимо знать эффективную константу реакции в присутствии ингибитора и константу Михаэлиса — в его отсутствие. KM,эф и KM можно найти, решая задачу графическим методом, например, в координатах Лайнуивера–Берга:

1, для случая протекания процесса с ингибитором и без ингибитоv0 cS ра. Константу ингибирования можно рассчитать по уравнению (10.16) или определить непосредственно из графика, так как отношение тангенсов угла наклона прямых в точке пересечения с осью ординат равно cI.

1 KI 2. Ингибитор не конкурирует с субстратом за активный центр, так как присоединяется к другой части молекулы белка с образованием неактивных комплексов (EI и ESI), имеющих константы равновесия:

cEcI cEScI KI, K (10.17) cEI cESI Наличие ингибитора в этом случае приводит к снижению активности фермента, но не изменяет его сродство к субстрату.

Если достигается обратимость ингибирования, то есть восстановление активности фермента под действием отличных от субстрата веществ, такое ингибирование называется неконкурентным.

Если оба комплекса (EI и ESI) неактивны, то есть не дают продук та, а константы их диссоциации близки между собой ( KI K ), то это равносильно дополнительному условию: ингибитор не мешает взаимодействию субстрата с ферментом, но уменьшает скорость реакции из-за неактивности образующихся комплексов на поверхности фермента.

В этом случае константа Михаэлиса остается постоянной величиной, а изменяется максимальная скорость процесса:

vmax vmax,эф. (10.18) cI KI Уравнение Михаэлиса–Ментена в этом случае запишется как vmax,эфcS v0. (10.19) cS KM 0 Если cI KI и cS KM, то скорость реакции ингибирования будет равна vmax / 4.

Выражение для константы ингибирования получим из (10.18):

cI KI. (10.20) vmax / vmax,эф Линеаризация уравнения (10.19) и обработка экспериментальных 1 данных для неконкурентного ингибирования в координатах поv0 cS зволяет определить KM, vmax, vmax,эф и KI, зная cI.

3. При бесконкурентном ингибировании образуется один неактивированный комплекс (ESI) с константой равновесия cEScI K. (10.21) cESI Уравнение Михаэлиса–Ментена в этом случае запишется как vmax,эфcS v0, (10.22) cS KM,эф где KM KM,эф. (10.23) cI KI В этом случае эффективная константа отличается от значения для конкурентного ингибирования, но эффективная скорость выражается уравнением, аналогичным для неконкурентного ингибирования.

Линеаризация уравнения (10.22) и обработка экспериментальных 1 данных для неконкурентного ингибирования в координатах поv0 cS зволяет определить KM, KM,эф, vmax, vmax,эф и KI, зная сI0.

10.3. ПРИМЕРЫ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ Пример 1. Рассчитайте значение константы Михаэлиса и значение максимальной скорости ( KM и vmax ) всеми возможными методами для реакции гидролиза метилового эфира N-бензоил-L-аминомасляной, катализируемого -химотрипсином. Известны данные о зависимости начальной скорости от концентрации субстрата:

cS ·103, М 2,24 2,24 1,49 1,49 1,12 1,12 0,90 0,90 0,75 0,v0 · 107, моль/с 4,25 4,31 3,52 3,60 3,10 3,12 2,71 2,77 2,45 2,Решение. Для графического решения преобразуем уравнение Михаэлиса–Ментена в линейную форму.

1-й способ Лайнуивера–Берка Уравнение приводится к виду:

1 1 KM 0.

v0 vmax vmax cS 1 Рассчитанные значения, заносим в таблицу и строим график cS vв соответствующих координатах.

1 cS · 10–2, М–4,46 4,46 6,71 6,71 8,93 8,93 11,11 11,11 13,33 13,1 v0 · 10–6, с/моль 2,35 2,32 2,84 2,78 3,23 3,21 3,69 3,61 4,08 4,048 12 1/cS0 · 102, MОтрезок на оси ординат получается равным 1/vmax = 1,45 · 106, поэтому vmax = 1/(1,45 · 106) = 6,9 · 10–7 моль/с.

Тангенс угла наклона прямой равен tg = 2000, следовательно KМ = tg · vmax = 2000 · 6,9 · 10–7 = 1,38 · 10–3 М.





2-й способ Лайнуивера–Берка Строят график по уравнению cS KM + cS v0 vmax vmax cS в координатах –cS.

vcS 103, М 2,24 2,24 1,49 1,49 1,12 1,12 0,90 0,90 0,75 0,cS v0 · 10–3, с/моль 5,27 5,20 4,23 4,14 3,61 3,59 3,32 3,25 3,06 3, 1/ v ·, c/моль cS0/v0 ·103, c/дм-2 -1 0 1 2 cS0 ·103, M Из графика получается, что прямая отсекает на оси ординат отрезок, равный KM vmax = 2 · 103, а на оси абсцисс отрезок, равный KМ = = –1,38 · 10–3. Поэтому KМ = 1,38 · 10–3 М, vmax = 1,38 · 10–3/(2 · 103) = = 6,9 · 10–7 моль/с.

Способ Эдди–Хофсти Уравнение приводится к виду v0 vmax KM v0 cS.

Строится график в координатах v0–v0 cS.

v0 cS · 104, дм3/с 1,90 1,92 2,36 2,42 2,77 2,79 3,01 3,08 3,27 3,v0 · 10–7, с/моль 4,25 4,31 3,52 3,60 3,10 3,12 2,71 2,77 2,45 2,0 1 2 3 4 v0/cS0 · 104, дм3/c v ·, моль/с График дает прямую линию, тангенс угла которой равен –1,36 · 10–3, а отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен 6,86 · 10–3. Поэтому KМ = 1,36 · 10–3 М, vmax = 6,86 · 10–3 моль/с.

Пример 2. Бензоат 1,2,5-триметилпиперидола-4 (-изомер) ингибирует гидролиз бутирилхолина, катализируемый холинэстеразой. Определите тип ингибирования и рассчитайте константу диссоциации комплекса фермент–ингибитор. Экспериментальные данные:

0 c-изомер · 105, М v0,·усл. ед.

cS · 104, М 10,00 5,2,50 4,0,91 2,0,50 2,10,00 4,2,50 3,0,0,91 2,0,50 1,10,00 4,2,50 3,1,0,91 2,0,50 1,10,00 2,2,50 2,2,0,91 1,0,50 1,10,00 2,2,50 1,3,0,91 1,0,50 0,Решение. Рассчитаем константу Михаэлиса и максимальную скорость реакции для различных концентраций ингибитора по способу Эдди–Хофсти. Так как неизвестен способ ингибирования, то используем эффективные значения константы Михаэлиса и максимальной скорости. Уравнение Михаэлиса–Ментена приведем к виду (по способу Эдди–Хофсти):

v v0 vmax,эф KM,эф 0.

cS Построим графики зависимостей в координатах v0–v0 cS для разных значений концентрации ингибитора.

Для c-изомер 0 :

v0 cS · 10–4, усл.ед./М 0,56 1,78 3,23 4,v0, усл.ед. 5,55 4,45 2,94 2,0 1 2 3 4 v0/cS0 · 104, усл.ед./М Уравнение прямой имеет вид v0 6,11 0,97 104 v0 cS, поэтому получаем vmax = 6,11 усл.ед., KM = 0,97 · 10–4 М.

Для c-изомер 0,5105 М:

v0 cS · 10–4, усл.ед./М 0,48 1,51 2,81 3,v0, усл.ед. 4,77 3,78 2,56 1,0 1 2 3 v0/cS0 · 104, усл.ед./М Уравнение прямой v0 5,23 0,96 104 v0 cS. Откуда vmax,эф = = 5,23 усл.ед., KM,эф = 0,96 · 10–4 М.

v, усл.ед.

v, усл.ед.

Для c-изомер 1,0 105 М:

v0 cS · 10–4, усл.ед./М 0,40 1,27 2,37 2,v0, усл.ед. 4,00 3,18 2,16 1,v0/cS0 · 104, усл.ед./М Уравнение прямой v0 4,40 0,96 104 v0 cS. Откуда vmax,эф = = 4,40 усл.ед., KM,эф = 0,96 · 10–4 М.

Для c-изомер 2,0 105 М:

v0 cS · 10–4, усл.ед./М 0,29 0,91 0,67 2,v0, усл.ед. 2,86 2,28 1,52 1,v0/cS0 · 104, усл.ед./М v, усл.ед.

v, усл.ед.

vУравнение прямой v0 3,16 0,98104. Откуда vmax,эф = cS = 3,16 усл.ед., KM,эф = 0,98 · 10–4 М.

Для c-изомер 3,0 105 М:

v0 cS · 10–4, усл.ед./М 0,24 0,63 1,36 1,v0, усл.ед. 2,38 1,58 1,24 0,2.2.2.1.1.0.0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 v0/cS0 · 104, усл.ед./М vУравнение прямой v0 2,41 0,90 104. Откуда vmax,эф = cS = 2,41 усл.ед., KM,эф = 0,90 · 10–4 М.

Как видно из полученных значений, константа Михаэлиса остается неизменной, а максимальная скорость меняется. На этом основании можно сделать вывод, что ингибирование — неконкурентное.

Рассчитаем константу ингибирования для c-изомер 1,0 105 М по уравнению:

cI KI ;

vmax / vmax,эф KI 5,3105 М.

5,23 / 4,40 v, усл.ед.

10.4. ЗАДАЧИ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОГО РЕШЕНИЯ 1. Определите значения vmax, KМ, и kкат гидролиза метилового эфира N-ацетил-1-фенилаланина, катализируемого трипсином, исходя из приведенных ниже данных. Начальная концентрация трипсина равна 1,41 · 10–6 моль/дм3.

cS · 103, моль/дм10,0 8,0 6,7 5,5 5,v0 · 106, моль/(дм3 с) 3,33 2,81 2,79 2,45 2,2. Определите значения кинетических параметров: vmax, KМ, и kкат гидролиза метилового эфира K-ацетил-1-валина, катализируемого -химотрипсином, исходя из приведенных ниже данных. Начальная концентрация фермента равна 3,8 · 10–5 моль/дм3.

cS, моль/дм0,200 0,124 0,091 0,071 0,v0 · 106, моль/(дм3 с) 4,57 3,83 3,31 2,93 2,3. Реакцию переноса аминогруппы с глутаминовой кислоты на щавелево-уксусную осуществляет фермент трансаминаза. Рассчитайте KМ, и vmax, исходя из приведенных ниже данных:

cS · 106, моль/дм0,30 0,50 2,00 4,00 10,v0 · 106, моль/(дм3 с) 0,17 0,27 0,65 0,78 0,4. При добавлении ингибитора в ферментативную систему, подчиняющуюся схеме Михаэлиса–Ментен, максимальная скорость реакции уменьшилась в 5 раз, а KМ не изменилась. Предложите схему ингибирования и рассчитайте KI, если концентрация ингибитора равнялась 4 · 10–5 моль/дм3.

5. Из приведенных ниже данных для ферментативной реакции, подчиняющейся схеме и уравнению Михаэлиса–Ментен, определите схему действия ингибитора при его концентрации cI = 6 · 10–3 моль/дм3.

Вычислите значения KМ, KI, и vmax.

cS · 103, моль/дм2,0 3,0 4,0 10,0 15,v0 · 106, г/(дм3 ч) 139 179 213 313 vI · 106, г/(дм3 ч) 88 121 149 257 6. Реакция восстановления пирувата лактатдегидрогеназой ингибируется высокими концентрациями субстрата. Определите значения кинетических параметров: KМ, KSI и vmax.

cS · 103, моль/дм0,03 0,05 0,50 0,70 3,00 10,v0 · 106, г/(дм3 ч) 3,70 4,39 4,9 3,90 1,80 1,7. Реакция иодида N-метил-7-цетоксихинолина, катализируемого ацетилхолинэстеразой, ингибируется субстратом с образованием неактивного комплекса ЕSI. Определите значения кинетических параметров: KМ, KSI и vmax.

Pages:     | 1 |   ...   | 16 | 17 || 19 | 20 |   ...   | 23 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.